牛春紅，田新強(qiáng)，朱壯彥

(大同大學(xué)，山西大同 037009)

芪葉保肝飲對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡作用的研究*

牛春紅，田新強(qiáng)，朱壯彥

(大同大學(xué)，山西大同 037009)

目的:研究芪葉保肝飲(SLPLD)對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用。方法:研究SLPLD清除DPPH自由基的能力和抗氧化作用;研究不同劑量SLPLD對HepG2細(xì)胞增殖與凋亡的作用;建立小鼠腫瘤模型，實(shí)驗(yàn)組灌胃SLPLD，至第30天時(shí)結(jié)束描繪移植瘤生長曲線、稱量終末移植瘤質(zhì)量并計(jì)算抑瘤率。結(jié)果:SLPLD清除DPPH自由基能力隨劑量增加而升高，呈線性相關(guān):R2= 0.9947，IC50=15.74ul;SLPLD對HepG2細(xì)胞增殖結(jié)果顯示細(xì)胞數(shù)量隨SLP著LD劑量增加而減少。流式結(jié)果顯示隨SLPLD使用劑量增加，HepG2細(xì)胞凋亡率由9.23%逐漸增加到42.9%;小鼠腫瘤模型第30天時(shí)SLPLD實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積與平均腫瘤重顯著小于對照組，腫瘤抑制率為40.3%。結(jié)論:SLPLD這一新型中成藥具有較強(qiáng)的抗氧化活性，能夠抑制HepG2肝癌細(xì)胞增長，促進(jìn)其凋亡。

芪葉保肝飲;HepG2;抗氧化活性;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡

我國每年因肝癌死亡者高達(dá)60萬人，達(dá)全球肝癌患者總數(shù)的50%以上，且發(fā)病率呈現(xiàn)一定上升勢態(tài)。當(dāng)前臨床通常采用手術(shù)以及放療和化療的方式治療肝癌，對抑制腫瘤細(xì)胞的增生起到一定的效果，但往往伴隨較大的毒副作用。近年來，中醫(yī)藥治療肝癌逐步得到認(rèn)可，中藥可以提高機(jī)體的抗氧化作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，達(dá)到防癌治癌的目的［1］。同時(shí)中藥性質(zhì)比較溫和，對患者身體的損傷較小，具有較強(qiáng)的臨床應(yīng)用和推廣價(jià)值。

芪葉保肝飲(SLPLD)為治療肝癌的中成藥，主要成分來源于正北芪(恒山黃芪)、松葉、橘葉、竹葉、枸杞和蘆根等中藥，其中黃芪是生產(chǎn)SLPLD的主要原料。黃芪、枸杞補(bǔ)中益氣，具有增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能、保肝、抗腫瘤、清除自由基和抗衰老等作用［2-4］。有研究表明，竹葉黃酮是一種極具開發(fā)潛力的天然抗氧化劑［5］。本文通過研究 SLPLD對HepG2肝癌細(xì)胞凋亡的作用，初步研究其對小鼠腫瘤生長的影響，為SLPLD抗腫瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

BALB/C雄性裸鼠50只，體質(zhì)量20 g～26 g，購于中科院北京實(shí)驗(yàn)動物中心(許可證編號SCXK京2011-0004)，在山西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心清潔喂養(yǎng)。

1.2 材料及試劑

SLPLD為中成藥，成分包括正北芪(恒山黃芪)、松葉、橘葉、竹葉、枸杞和蘆根。人肝癌細(xì)胞株HepG2(本實(shí)驗(yàn)室保存)，二苯基苦基苯肼自由基(DPPH)(美國Sigma公司，批號 S43654-098)，Cell Proliferation Reagent WST-1試劑盒、nuclear/cytosolfractionation kit、BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光液(美國pierce公司)。

1.3 SLPLD清除DPPH自由基的作用

用PBS將SLPLD稀釋成不同濃度，分別取15 μL原液稀釋2倍、4倍樣品和60 μL 17 mmol/L Tris-HCl(pH7.4)以及150 μL 1 mmol/L DPPH溶液混合，避光反應(yīng)30 min。同時(shí)用水溶性維生素 E (Trolox)作為陽性對照［3］，乙醇溶液作為顏色空白對照，PBS作為空白對照。均取波長520 nm下的反應(yīng)液吸光值，最后按下述公式計(jì)算:自由基清除率=［OD520(空白對照)－(OD520(樣品)－OD520 (顏色對照)/OD520(空白對照)］×100%。得到樣品的自由基清除率，在相同DPPH自由基清除率下的樣品濃度對應(yīng) Trolox濃度，為此濃度樣品的Trolox當(dāng)量濃度。

通過回歸分析得出多糖濃度與清除率之間的回歸方程，根據(jù)方程計(jì)算出其IC50(清除率為50%時(shí)的濃度)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 SLPLD對HepG2細(xì)胞增殖及凋亡的影響

1.4.1 HepG2細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2(本實(shí)驗(yàn)室保存)細(xì)胞復(fù)蘇后，于12%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，含1%的青鏈霉素(100 IU/ml青霉素和100 ng/ml鏈霉素)以及2 mM的谷氨酸，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。換液周期為1～2 d，3～4 d傳代1次。

1.4.2 SLPLD對HepG2細(xì)胞增殖的影響 用Cell Proliferation Reagent WST-1(Roche，USA)試劑盒檢測HepG2細(xì)胞在SLPLD作用下的活力和增殖情況。在96孔板中加入2×104個(gè)/孔HepG2細(xì)胞，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h后，分別加入5 μL、10 μL、15 μL和20 μL SLPLD處理細(xì)胞，對照組分別加入與之相同劑量的PBS(空白對照)和板藍(lán)根溶液(板藍(lán)根注射液，山西太原藥業(yè)有限公司，陰性對照)孵育18 h。棄上清培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入20 μL WST-1試劑和180 μL培養(yǎng)基孵育1 h，分別讀取各組在450 nm處的吸光值。

1.4.3 流式細(xì)胞儀檢測SLPLD對HepG2細(xì)胞凋亡的作用 ①在6孔板中，每孔加入2×105個(gè)/孔HepG2細(xì)胞，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h，0 μL、25 μL、50 μL、75 μL、100 μL SLPLD處理16 h，胰酶消化，含12%胎牛血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng)，1000 rpm、8 min離心收集細(xì)胞。PBS洗滌3次，1000 rpm、8 min離心收集細(xì)胞;②加入500 ul的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，然后加入5 ul Armexin VAPC溶液混勻，室溫避光反應(yīng)15 min;③加入5 ul 7-AAD染液混勻，室溫避光反應(yīng)15 min;④1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長Ex=633 nm，最大發(fā)射波長Em=660 nm，Annexin V-APC的紅色熒光使用FL4通道檢測，激發(fā)波長Ex=546 nm，發(fā)射波長Em =647 nm，7-AAD紅色熒光使用FL3通道檢測。Em =647 nm，7-AAD紅色熒光使用FL3通道檢測。

1.5 SLPLD對小鼠腫瘤生長的影響

1.5.1 小鼠腫瘤模型的建立 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，胰酶消化后重懸于PBS中，調(diào)整細(xì)胞濃度至6.0×106個(gè)/ml。每只裸鼠背部皮下注射細(xì)胞懸液200 μL，所有實(shí)驗(yàn)小鼠均在恒溫(25± 1)℃、恒濕(50%±10%)、無特定病原體(SPF)條件下的層流架中飼養(yǎng)，自由飲食。移植腫瘤細(xì)胞10 d左右，挑選背部移植的腫瘤大小生長至100 mm3～200 mm3的小鼠20只用于試驗(yàn)。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)分組 將實(shí)驗(yàn)小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組和對照組2組各10只，實(shí)驗(yàn)組灌胃SLPLD 200 μL/只，每天早晚各1次，對照組灌胃同等劑量的生理鹽水。

1.5.3 SLPLD對小鼠腫瘤的影響 從首次給藥開始，用游標(biāo)卡尺每天測量記錄各組腫瘤體積，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤結(jié)節(jié)的長度和寬度(精確到0.002 cm)，按公式V=ab2/2計(jì)算腫瘤的體積［6］，至第30天時(shí)結(jié)束實(shí)驗(yàn)。在第30天時(shí)麻醉并處死裸鼠，手術(shù)剝離切除腫瘤組織稱重，并用如下公式計(jì)算抑瘤率［7］:腫瘤抑制率(%)=［1－(實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對照組平均瘤重)］×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLPLD的抗氧化作用

表1顯示，SLPLD清除DPPH自由基的能力隨劑量增加而升高且呈線性相關(guān)。它們之間的線性回歸方程為:y=0.029x+0.0434，R2=0.9947，IC50 =15.74 ul。隨著自由基清除率的增加，相對Trolox的當(dāng)量濃度也隨之增大。

表1 SLPLD對DPPH自由基的清除作用(±s)

表1 SLPLD對DPPH自由基的清除作用(±s)

SLPLD劑量(μL) 清除率(%) Trolox當(dāng)量濃度(μg/ml) 3.75 12.3±1.9 24.7± 1.6 7.50 28.2±3.1 41.3± 1.7 15．00 49.9±7.5 75.7± 9.2 30．00 90.3±8.7 180.6±16.8

2.2 SLPLD對HepG2細(xì)胞增殖及凋亡影響

2.2.1 SLPLD對HepG2細(xì)胞的增殖作用 圖1顯示，不同劑量板藍(lán)根和PBS處理下的HepG2細(xì)胞數(shù)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SLPLD實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量隨著劑量增加而減少。15 ul和20 ul的SLPLD實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞數(shù)量顯著少于板藍(lán)根組和PBS組(P＜0.05)。

2.2.2 流式細(xì)胞儀檢測SLPLD對HepG2細(xì)胞凋亡的作用 圖2顯示，X軸表示APC染色熒光，Y軸表示7-AAD染色熒光;A區(qū)表示壞死細(xì)胞，表現(xiàn)為APC-/7一AAD+;B區(qū)表示晚期凋亡細(xì)胞，表現(xiàn)為ApC+/7-AAD+;C區(qū)表示正常細(xì)胞，表現(xiàn)為APC一/7～AAD-;D區(qū)表示早期凋亡細(xì)胞，表現(xiàn)為APC+/7-AAD-。隨著SLPLD劑量的增加，晚期凋亡細(xì)胞比例逐漸增加，由9.23%增加到42.9%。

2.3 SLPLD對小鼠腫瘤生長的作用

圖1 SLPLD對HepG2細(xì)胞增殖的作用

圖3、4顯示，SLPLD實(shí)驗(yàn)組與對照組隨著時(shí)間增加，腫瘤體積均逐漸增大。第30天時(shí)，SLPLD實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積(7.52±3.63)mm3顯著小于對照組(11.07±4.12)mm3(P＜0.05)。稱量對照組平均腫瘤質(zhì)量為(4.57±0.82)g，SLPLD實(shí)驗(yàn)組平均腫瘤質(zhì)量為(2.73±0.82)g，實(shí)驗(yàn)組質(zhì)量小于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，腫瘤抑制率為40.3%。

3 討論

早在上世紀(jì)80年代，人們就發(fā)現(xiàn)自由基與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)。自由基通過作用于 DNA導(dǎo)致機(jī)體遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能變化，肽鍵斷裂、非正常聚合以及脂質(zhì)過氧化等，最終可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［8］。研究發(fā)現(xiàn)，采用抗氧化劑干預(yù)、阻斷自由基的形成，可以預(yù)防腫瘤發(fā)生［9-10］。本研究顯示，SLPLD具有較強(qiáng)的清除自由基的能力。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測SLPLD對HepG2細(xì)胞凋亡的作用

圖3 SLPLD對小鼠腫瘤生長的作用

圖4 SLPLD對小鼠腫瘤生長作用變化曲線

宋巖［11］等研究表明，黃芪可顯著抑制HepG2細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡率隨黃芪濃度增加而逐漸升高，存在劑量依賴性。耿國軍［12］等研究黃芪對肺腺癌細(xì)胞生長的影響，表明不同濃度的黃芪處理后細(xì)胞生長受到明顯抑制，細(xì)胞生長抑制率隨黃芪的濃度增加而增長。本研究結(jié)果表明，SLPLD能抑制HepG2細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，隨著SLPLD的劑量增加，晚期凋亡細(xì)胞比例呈逐漸增加趨勢，說明SLPLD具有致HepG2細(xì)胞凋亡的作用。

谷俊朝［13］等通過研究黃芪多糖對TA2小鼠乳腺癌MA-891移植瘤生長發(fā)現(xiàn)，服用黃芪多糖的小鼠瘤質(zhì)量有所減輕，具有一定的抑瘤作用。劉成軍［14］等研究黃芪注射液對人鼻咽癌CNE2裸鼠移植瘤的抑制作用，結(jié)果顯示黃芪注射液高、中劑量組移植瘤體積明顯低于對照組，瘤質(zhì)量明顯低于對照組，抑瘤率分別為39.90%、30.77%。任美萍［15］等研究表明，黃芪多糖在50、100 mg/kg時(shí)，對H22的抑瘤率分別為32.84%、45.09%，對S180的抑瘤率分別為36.55%、50.35%。本研究通過在小鼠皮下注射HepG2細(xì)胞建立相應(yīng)的腫瘤模型，給裸鼠灌胃適量的SLPLD治療并觀察腫瘤生長變化情況，通過測量腫瘤體積以及質(zhì)量評估SLPLD的治療效果，結(jié)果表明SLPLD對腫瘤的生長有一定的抑制作用。

綜上所述，SLPLD這一新型中成藥具有較強(qiáng)的抗氧化活性，能夠抑制HepG2肝癌的生長，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，并對抑制腫瘤的生長有一定作用，值得臨床推廣應(yīng)用。

［1］楊靜，馬力文．腫瘤與機(jī)體抗氧化系統(tǒng)［J］．腫瘤防治雜志，2004，11(3):324-327．［2］鐘靈，王振富，文德鑒．黃芪多糖抗衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］．中國應(yīng)用生理學(xué)志，2013，29(4):350-352．

［3］王建華，張民，甘璐，等．枸杞多糖-2的抗羥基自由基氧化作用［J］．食品科學(xué)，2001，22(01):11-13．

［4］張薔，高文遠(yuǎn)，滿淑麗．黃芪中有效成分藥理活性的研究進(jìn)展［J］．中國中藥志，2012，58(21):3203-3207．

［5］潘進(jìn)權(quán)，張世英，何敏婷，等．竹葉總黃酮提取工藝及抗氧化特性的研究［J］．中國食品學(xué)報(bào)，2012，12(3):39-44．

［6］Wang J，Sun L，Myeroff L，et al．Demonstration that mutation of the type II transforming growth factor beta receptor inactivates its tumor suppressoractivity in replication error-positive colon carcinoma cells［J］．J Biol Chem，1995，270(37):22044-22049．

［7］章紅燕，何福根，姜建偉．小柴胡湯對H22肝癌小鼠癌細(xì)胞的增殖抑制作用及其作用機(jī)制研究［J］．中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014，33(06):1386-1388．

［8］趙春艷．沙蔥中黃酮類化合物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其對小鼠免疫抗氧化機(jī)能影響的研究［D］．呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008:45-46．

［9］Soria E A，Eynard A R，Quiroga P L，et al．Differential effects of quercetin and silymarin on arsenite-induced cytotoxicity in two human breast adenocarcinoma cell lines［J］．Life Sci，2007，81 (17-18):1397-1402．

［10］Factor V M，Laskowska D，Jensen M R，et al．Vitamin E reduces chromosomal damage and inhibits hepatic tumor formation in a transgenic mouse model［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97 (5):2196-2201．

［11］宋巖，劉秀萍，白偉良，等．黃芪對喉癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響［J］．實(shí)用藥物與臨床，2013，16(1):5-7．

［12］耿國軍，姜杰，杜好信，等．黃芪對肺腺癌細(xì)胞生長抑制的實(shí)驗(yàn)研究［J］．實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床，2011，11(1):4-5．

［13］谷俊朝，余微波，王宇，等．黃芪多糖對TA2小鼠乳腺癌MA-891移植瘤生長及HSP70表達(dá)的影響［J］．中華腫瘤防治雜志，2006，13(20):1534-1537．

［14］劉成軍，桑國優(yōu)，韋世秀，等．黃芪注射液對人鼻咽癌CNE2裸鼠移植瘤的抑制作用［J］．中草藥，2010，41(6):968-970．

［15］任美萍，劉明華，李蓉，等．黃芪多糖抗腫瘤活性研究［J］．中國新藥雜志，2010，19(3):221-224．

Study of Qiye Baogan Decoction on Proliferation and Apoptosis of Hepatocellular Carcinoma Cells

NIU Chun-hong，TIAN Xin-qiang，ZHU Zhuang-yan△
(Datong University，Datong，Shanxi 037009，China)

Objective:To study the role of Qi Ye Bao Gan Yin(SLPLD)in liver cancer cell proliferation and apoptosis．Method:Study the SLPLD’s ability of DPPH scavenging and its antioxidant effect．Research the Effect of different doses SLPLD on appreciation of HepG2 cells．Established the tumor model in mice．The experimental group was given SLPLD．Experiment were ended at the 30thday．Depict the tumor growth curve，weighing the terminal tumor mass，and inhibition rate was calculated．Result:DPPH scavenging ability positively correlated with the dose of SLPLD，and showed．linear correlation R2=0.9947，IC50=15.74ul．SLPLD’s effect on HepG2 cell proliferation and apoptosis showed that in SLPLD experimental group，cell number and the doses of SLPLD were negatively correlated．In SLPLD group with SLPLD dose increase，HepG2 cell apoptosis rate increasing from 9.23%to 42.9%gradually．③At the 30th day，SLPLD tumor volume in experimental group was significantly smaller than the control group．Tumor inhibition rate was 40.3%．Conclusion:The new medicine SLPLD shows a strong antioxidant activity，it can inhibit the growth of HepG2 and promote its apoptosis．

SLPLD;HepG2;Antioxidant activity;Cell proliferation;Apoptosis

R285．5

B

1006-3250(2016)01-0059-03

2015-05-09

山西省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目-糖尿病、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制、并發(fā)癥及影響因素的研究-芪葉保肝飲對酒精性肝病的臨床應(yīng)用研究(20130313017-1)

牛春紅(1973-)，女，黑龍江齊齊哈爾人，副教授，醫(yī)學(xué)碩士，從事肝病的臨床與研究。