趙 璠，劉旭東，劉文俊，柴紀嚴，于化新，王凌志，王 路，王德山，單德紅

(遼寧中醫(yī)藥大學，沈陽 110847)

M2和M3型膽堿能受體在脾氣虛大鼠小腸運動中的作用*

趙 璠，劉旭東，劉文俊，柴紀嚴，于化新，王凌志，王 路，王德山，單德紅△

(遼寧中醫(yī)藥大學，沈陽 110847)

目的:研究M2、M3型膽堿能受體表達與脾氣虛小腸運動的關(guān)系。方法:20只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組和脾氣虛模型組(模型組)各10只，模型組大鼠復(fù)制飲食不節(jié)加勞疲型脾氣虛模型;小腸運動采用小腸推進率評價;ELISA法檢測小腸組織Ach和cAMP含量，免疫組化法觀察M2、M3型受體表達。結(jié)果:與對照組比較，模型組大鼠的小腸推進率顯著下降，Ach含量無變化，M2受體表達明顯上升，M3受體表達和cAMP水平顯著下降。結(jié)論:脾氣虛小腸運動減弱與M2、M3型受體表達異常有關(guān)。

脾氣虛;小腸運動;M型膽堿能受體;Ach;cAMP

小腸運動異常是脾氣虛的常見癥狀，其現(xiàn)代醫(yī)學機制至今未明。小腸平滑肌受迷走神經(jīng)和腸內(nèi)神經(jīng)支配，其末梢均可大量釋放乙酰膽堿(Ach)，再通過M2、M3型膽堿能受體共同調(diào)控小腸運動。研究發(fā)現(xiàn)，Ach結(jié)合M3受體可通過多條途徑提高胞內(nèi)Ca2+濃度，在平滑肌收縮中起主要作用，而M2受體激活則能抑制腺苷酸環(huán)化酶活性，降低cAMP水平，間接控制平滑肌收縮［1-2］。膽堿能系統(tǒng)是調(diào)控胃腸功能最經(jīng)典的系統(tǒng)，但其與脾氣虛的關(guān)系至今尚不清楚。因此，本研究以飲食失節(jié)加勞倦型脾氣虛大鼠為載體，通過檢測小腸推進率、小腸組織Ach水平、M2和M3受體表達及cAMP含量等，探討脾氣虛狀態(tài)下小腸運動與M2、M3受體的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

20只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±10)g，購于遼寧省本溪巿實驗動物中心(許可證號SCXK (遼)-2010-0001)，按隨機數(shù)字表法分為對照組和脾氣虛組(模型組)各10只。飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心(許可證號SYXK(遼)-2013-000-9)，室溫18℃～23℃，相對濕度45%～55%，自由飲水進食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2 模型復(fù)制方法及評價標準

復(fù)制飲食失節(jié)加勞倦型脾氣虛模型，即14 d內(nèi)單日飽食，雙日喂飼甘藍，每日水溫35℃～37℃游泳至力竭。評價標準:大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降、食少、神疲乏力、毛色枯槁無光澤等。

1.3 大鼠代謝水平檢測

造模結(jié)束后，先測量2組大鼠體質(zhì)量再放入代謝籠，觀察24 h進食量、飲水量、尿量、大便含水率［(大便濕重－大便干重)÷大便濕重×100%］。

1.4 大鼠神疲乏力評價

采用曠場實驗評價其中樞性疲勞，即神疲;前肢抓力評價軀體疲勞，即乏力。曠場實驗采用TMVision行為學實驗系統(tǒng)，將大鼠放入箱體中心，觀察5 min內(nèi)大鼠的靜止時間、運動時間、運動距離和垂直活動次數(shù)等，徹底清潔箱體后檢測下一只。大鼠前肢抓力采用YLS-13A大小鼠抓力測定儀檢測，連續(xù)測量3次取平均值。

1.5 小腸推進率測定

大鼠禁食不禁水24 h后，給予10%炭粉混懸液(5%活性炭和10%阿拉伯膠)灌胃(1 ml/100 g)，30 min后麻醉大鼠(10%水合氯醛，0.35 ml/100 g)，打開腹腔提取幽門至回盲部的腸管，用直尺測量炭末推進距離。按公式計算:小腸推進率=炭粉前端至幽門括約肌距離(cm)/幽門括約肌至小腸末端距離(cm)×100%。

1.6 小腸組織Ach、cAMP水平檢測

麻醉大鼠后取幽門下1 cm～2 cm小腸，4℃鹽水洗去內(nèi)容物凍存。采用ELISA方法，Ach試劑盒購于沈陽鼎國生物技術(shù)有限公司，cAMP試劑盒購于北京冬歌博業(yè)生物技術(shù)有限公司，應(yīng)用Bio-Rad美國伯樂iMark酶標儀按說明書操作。

1.7 M2和M3受體表達

采用免疫組化方法。取4%多聚甲醛固定后小腸，放入PBS液漂洗，PBS沖洗3次×5 min;滴加正常山羊血清，室溫20 min;滴加兔抗大鼠M2或M3抗體(購于沈陽鼎國生物技術(shù)有限公司)，4℃過夜，PBS沖洗3次×5 min;滴加生物素標記羊抗兔IgM抗體，室溫30 min，PBS沖洗 3次 ×5 min;加入SABC試劑，室溫30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照采用抗體稀釋液代替一抗，步驟同上。利用BI-2000系統(tǒng)，在光鏡下(10×40倍)選取相同部位相同視野照相分析，計算每個視野陽性染色的平均光密度(MOD)。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(±s)表示，主要采用ANOVA進行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 模型評價結(jié)果

表1、2圖1顯示，與對照組比較，模型組大鼠的體質(zhì)量、進食量及飲水量均顯著下降(P＜0.05，P＜0.01)，表明大鼠出現(xiàn)消瘦、食少;靜止時間顯著延長(P＜0.01)，運動時間、運動距離、垂直活動次數(shù)均顯著減少(P＜0.05，P＜0.01)，提示大鼠對新鮮環(huán)境刺激減弱，反應(yīng)較差，表明其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性下降，出現(xiàn)“神?！?大鼠前肢抓力均顯著下降(P＜0.05)，提示其肌力不足，處于“乏力”狀態(tài);肉眼可見大鼠被毛蓬起無光澤。以上結(jié)果表明，飲食失節(jié)加勞倦型脾氣虛模型復(fù)制成功。

表1 大鼠一般生物指征(±s)

表1 大鼠一般生物指征(±s)

注:與對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組 別 鼠數(shù) 體質(zhì)量(g) 進食量(g) 飲水量(ml) 尿量(ml) 糞便含水率(%)對照組 10 362.58±24.81 33.03±10.90 86.3±21.6 9.6±3.8 24.21±5.94模型組 10 244.28±15.13＊＊ 24.52± 6.50* 55.2±13.7＊＊11.2±1.5 21.45±8.21

表2 大鼠神疲乏力情況(±s)

表2 大鼠神疲乏力情況(±s)

注:與對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組 別 鼠數(shù) 靜止時間(s) 運動時間(s) 運動距離(cm) 垂直活動次數(shù)(次/5 min) 前肢抓力(g)對照組 10 243.27±10.34 56.74±10.34 9512.90±1881.5920.6±5.9 1363.54±105.83模型組 10 267.85± 7.82＊＊ 32.18± 7.83＊＊ 4930.35±1253.18＊＊ 15.3±3.6* 1215.54±127.72*

表3 小腸推進率及膽堿能系統(tǒng)相關(guān)指標變化(±s)

表3 小腸推進率及膽堿能系統(tǒng)相關(guān)指標變化(±s)

注:與對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組 別 鼠數(shù) 小腸推進率 Ach(μmol/L) M2受體表達 M3受體表達 cAMP(μmol/L)對照組 10 60.1±13.1 3.42±0.40 0.119±0.011 0.179±0.011 13.52±1.59模型組 10 46.4± 3.7* 3.37±0.51 0.214±0.010＊＊ 0.131±0.006＊＊ 10.63±2.11*

圖1 大鼠典型運動軌跡(0→MAX表示停留時間增加)

2.2 小腸推進率及膽堿能系統(tǒng)相關(guān)指標變化

表3顯示，與對照組比較，模型組大鼠的小腸推進率、M3受體表達和cAMP水平均明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)，而 M2受體表達顯著上升(P＜0.01)，但Ach含量無變化(P＞0.05)。

3 討論

小腸推進率是評價脾氣虛小腸動力的常用指標，但實驗結(jié)果不盡相同，這可能與模型的復(fù)制方法不同有關(guān)［3-5］。本實驗采用模型復(fù)制方法為復(fù)合因素法，但由于脾氣虛的病因較多，如飲食不節(jié)、勞倦過度、憂思日久、素體虛弱、年老體衰、大病初愈等，難以全面模擬，因此只模擬前二者，即將饑飽失常和力竭游泳作為干預(yù)因素，這符合“飲食自倍，腸胃乃傷”、“谷不入，半日則氣虛，一日則氣少”、“勞則氣耗”等中醫(yī)理論，從而在入口處使模型復(fù)制具有一定的脾氣虛趨向性。而在模型復(fù)制的出口處，通過對相關(guān)癥狀進行客觀性評價，確保模型復(fù)制成功。需要提出的是，該模型并不具備脾氣虛的全部內(nèi)涵，可能更適用于消化吸收方面的研究。

以此模型為載體，本實驗觀察到大鼠的小腸推進率下降，表明此種脾氣虛模型大鼠的小腸動力不足。作為調(diào)控胃腸功能的最經(jīng)典神經(jīng)系統(tǒng)之一，膽堿能系統(tǒng)在脾氣虛中的作用雖早有研究，但隨著現(xiàn)代醫(yī)學的不斷發(fā)展，其與脾氣虛的關(guān)系也應(yīng)有新的進展。胃腸道主要分布2種膽堿能受體M2和M3，二者共同調(diào)控胃腸平滑肌運動，但作用不同。M2受體起條件作用，能夠抑制腺苷酸環(huán)化酶，降低cAMP水平，限制平滑肌舒張，還能激活非選擇性陽離子通道，如促進Na+內(nèi)流，使平滑肌細胞去極化，提高其興奮性［6-7］;M3受體起主導作用，主要通過磷酯酶Cβ促進三磷酸肌醇、二酰甘油等合成，提高胞內(nèi)Ca2+濃度，引起平滑肌收縮，還可以對M2受體介導的陽離子流起允許作用［8］。脾氣虛狀態(tài)下，小腸平滑肌M2和M3受體的作用目前還未見報道。

本實驗觀察到，模型組大鼠小腸組織中Ach的含量無顯著變化，但M2受體表達增多、M3受體表達減少，同時伴有cAMP含量下降，這表明脾氣虛狀態(tài)下，膽堿能神經(jīng)節(jié)后纖維釋放Ach的能力雖無明顯變化，但效應(yīng)器應(yīng)答卻發(fā)生了變化。M3受體表達減少，會降低胞內(nèi)Ca2+水平，導致平滑肌收縮力明顯下降，而M2受體表達增加雖會在一定程度上增強平滑肌的收縮功能，但其作用有限，難以彌補由M3受體表達下降所造成的肌力損失，特別是M3受體表達下降還會削弱M2受體所介導的內(nèi)向陽離子流，導致平滑肌去極化程度下降，進而降低其興奮性，使小腸平滑肌對腸道內(nèi)容物的刺激不敏感。因此，M3受體表達減少和M2受體表達增多，可能就是脾氣虛小腸運動變?nèi)醯闹饕?。不過需要指出的是，小腸平滑肌有縱行肌和環(huán)形肌2種，收縮方式不同，而本實驗并沒有加以區(qū)分，這將在以后實驗中進行深入探討，進一步揭示脾氣虛狀態(tài)下小腸的不同運動形式與膽堿能受體的關(guān)系。

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Role of M2and M3Type Cholinergic Receptors in the Small Intestine of Rats with Spleen Qi Deficiency

ZHAO Fan，LIU Xu-dong，LIU Wen-jun，CAI Ji-yan，YU Hua-xin，WANG Ling-zhi，WANG Lu，WANG De-shan，SHAN De-hong△
(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China)

Objective:To study the roles of M2and M3receptors in the small intestine(SI)movement of Spleen-Qi deficiency rats．Methods:20 male SD rats were randomly divided in the control and Spleen-Qi deficiency(model group) groups，10 rats in each group;Spleen-Qi deficiency model of improper diet and over-fatigue type was established;The SI propelling rate was used to valuate the SI motion;ELISA was used to measure the Ach and cAMP concentrations in SI tissue;Immohistochemistry was employed to test expressions of M2and M3receptors．Results:compared with those in control，the SI propelling rate was significantly reduced，Ach concentration was not changed，M2receptor expression was markedly increased．Both M3receptor expression and cAMP concentration were significantly decreased in the model group．Conclusion:the reduction of the SI motion in Spleen-deficiency model rats was contributed to the abnormal expressions of M2and M3receptor．

Spleen-Qi deficiency;small intestine motion;M cholinergic receptor;Ach;cAMP

R285．5

B

1006-3250(2016)01-0041-03

2015-02-12

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃) (2013CB531702)

趙 璠(1977-)，女，主治醫(yī)師，醫(yī)學學士，從事中醫(yī)藥防治消化疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。

△通訊作者:單德紅，男，教授，醫(yī)學博士，Tel:024-31207089，E-mail:dehongshan@lnutcm．edu．cn。