430060 武漢大學(xué)人民醫(yī)院

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microRNA在睪丸腫瘤中的最新進(jìn)展

譚于龍綜述錢(qián)輝軍審校

430060 武漢大學(xué)人民醫(yī)院

關(guān)鍵詞：微小RNA；睪丸腫瘤；生物標(biāo)志物

在世界范圍，睪丸腫瘤是泌尿生殖系統(tǒng)少見(jiàn)的腫瘤之一，只占泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤的5%左右。然而，20~35歲的年輕男性睪丸腫瘤的發(fā)病率高于其他腫瘤。在我國(guó)，睪丸腫瘤占泌尿生殖系統(tǒng)的3%~9%[1]。2004年國(guó)際衛(wèi)生組織(WHO)將睪丸腫瘤的病理亞型分為：生殖細(xì)胞腫瘤(包括精原細(xì)胞瘤、卵黃囊瘤、畸胎瘤等)；性索/性腺間質(zhì)腫瘤(包括間質(zhì)細(xì)胞瘤、支持細(xì)胞瘤等)；其他非特異性間質(zhì)腫瘤。超過(guò)95%的睪丸癌為睪丸生殖細(xì)胞腫瘤(testicular germ cell tumor/TGCT)。睪丸癌多為單側(cè)發(fā)病，雙側(cè)發(fā)病者僅占1%左右。目前對(duì)睪丸腫瘤的發(fā)病機(jī)制還不十分清楚，危險(xiǎn)因素包括隱睪或睪丸下降不全、家族遺傳因素、Klinefelter綜合征等。近年來(lái)，遺傳學(xué)研究的不斷進(jìn)步，改善了臨床上對(duì)睪丸腫瘤的診斷和治療。表觀遺傳學(xué)研究作為遺傳學(xué)研究的新分支，有望為睪丸腫瘤的診斷及分型、制定治療方案和監(jiān)測(cè)治療效果、預(yù)測(cè)預(yù)后帶來(lái)一場(chǎng)革命。

1microRNA的合成、運(yùn)輸及作用機(jī)制

隨著對(duì)人類(lèi)基因組認(rèn)識(shí)的不斷加深，我們現(xiàn)在認(rèn)識(shí)到，只有不到2%的基因是由編碼區(qū)(外顯子)組成的，而這些編碼區(qū)就是合成mRNA的模版[2]。過(guò)去認(rèn)為余下的基因沒(méi)有生物功能，然而，近20年來(lái)，這些非編碼區(qū)的功能被不斷發(fā)掘出來(lái)，對(duì)應(yīng)的RNA命名為非編碼RNA(non-coding RNA)[3]，其中一類(lèi)稱(chēng)為微小RNA(microRNA/miRNA)。原始miRNA(primary miRNA/pri-miRNA)是莖環(huán)樣結(jié)構(gòu)，由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄得到，有多種miRNA基因定位于編碼基因的內(nèi)含子，其中的CpG島是miRNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，此外，DNA甲基化可以導(dǎo)致RNA聚合酶Ⅱ基因沉默。原始miRNA在細(xì)胞核內(nèi)通過(guò)微處理器剪切為獨(dú)立的發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)，稱(chēng)之為前體miRNA，然后通過(guò)exportin-5(輸出蛋白5)的協(xié)助運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)，經(jīng)Dicer剪切為長(zhǎng)度19～22個(gè)核苷酸的成熟miRNA[4]。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，miRNA完全或部分互補(bǔ)結(jié)合到靶mRNA，可以形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)，控制mRNA的降解或轉(zhuǎn)錄后翻譯抑制，最終調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[5]。每種miRNA可以調(diào)控多種mRNA，并且每種mRNA也都受到多種miRNA的調(diào)控。據(jù)估計(jì)，人類(lèi)有30%～70%的基因受miRNA調(diào)控[6]。研究表明，miRNA不僅參與正常的生理過(guò)程，如細(xì)胞分化、發(fā)育時(shí)序的控制、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等等，還涉及一些病理過(guò)程，例如腫瘤的發(fā)生[7]。

Voorhoeve等發(fā)現(xiàn)，在野生型p53存在的情況下，表達(dá)miR-372和miR-373的細(xì)胞，可以對(duì)抗DNA損傷而防止衰老。對(duì)這個(gè)機(jī)制進(jìn)一步的探討，發(fā)現(xiàn)miR-372和miR-373可以結(jié)合到p53的下游區(qū)域，并模仿無(wú)活性p53的功能[8]。鑒于腫瘤抑制因子2(large tumor suppressor 2，LATS2)刪失可以加速細(xì)胞增殖并最終導(dǎo)致腫瘤形成，研究者確定了LATS2是p53信號(hào)通路的潛在靶點(diǎn)。在一些LATS2突變的精原細(xì)胞瘤中，并不過(guò)表達(dá)miR-372和miR-373。LATS2蛋白抑制細(xì)胞周期蛋白E/CDK2的活性，從而中止細(xì)胞周期。最新的研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的精原細(xì)胞瘤和大多數(shù)胚胎癌都特定的過(guò)表達(dá)miR-372和miR-373[9]。

在精子發(fā)生的過(guò)程中，基因表達(dá)的時(shí)間性和空間性至關(guān)重要。精原細(xì)胞有周期性的轉(zhuǎn)錄沉默期，因而使得轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)顯得很重要[10]。無(wú)論是精原細(xì)胞瘤還是非精原細(xì)胞瘤，都是由早期的病灶發(fā)展而來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)原位癌(carcinoma in situ，CIS)源于精原細(xì)胞形成精子的功能障礙[11]。在精子的生發(fā)過(guò)程中，miRNA表達(dá)譜的改變與原位癌的發(fā)生密切相關(guān)，生發(fā)期間上調(diào)的miRNA有miR-136、miR-743a、miR-463，下調(diào)的miRNA有miR290-5p、miR291a-5p、miR-294、miR-293，對(duì)以上miRNA的靶點(diǎn)進(jìn)行分析，提示這些miRNA可能作用于PTEN、CXCR4以及Wnt/β-catenin信號(hào)通路，參與睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的轉(zhuǎn)移[12]。PTEN是一種腫瘤抑制因子，可以阻斷PI3K信號(hào)通路，從而對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用。因此PTEN的抑制促進(jìn)細(xì)胞增殖加速，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。原位癌的侵襲性轉(zhuǎn)化也涉及PTEN的缺失[13]。此外，作為PIK激酶的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，PIK3IP1的缺失與睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的復(fù)發(fā)率上升有關(guān)[14]。miR-199a的功能取決于其下游靶點(diǎn)。在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中，MAFB可能是miR-199a-5p的靶點(diǎn)，并且miR-199a-5p的腫瘤抑制效應(yīng)是由MAFB調(diào)控[15]。

2microRNA的診斷意義

通過(guò)多重分析和檢測(cè)手段，發(fā)現(xiàn)miR-371-3和miR-367對(duì)于睪丸癌的診斷有重要意義。在診斷的過(guò)程中，可以從患者的血清中分離這些miRNA，并與正常對(duì)照做對(duì)比。在一項(xiàng)包含病理確診患者和正常對(duì)照的研究中，傳統(tǒng)的AFP和hCG檢查的診斷準(zhǔn)確率不超過(guò)60%，并且對(duì)精原細(xì)胞瘤的診斷準(zhǔn)確率僅有40%，但在結(jié)合TsmiR檢測(cè)之后，診斷準(zhǔn)確率提高到98%[16]。在精原細(xì)胞瘤的診斷中，TsmiR檢測(cè)相對(duì)現(xiàn)有的AFP/hCG檢查的優(yōu)勢(shì)巨大。這個(gè)結(jié)果在探討其他起源的睪丸癌的研究中得到了進(jìn)一步確認(rèn)[17]。然而，對(duì)于患者血清中的miRNA水平是否可以預(yù)測(cè)存在轉(zhuǎn)移灶，還需要做進(jìn)一步的研究。此外，miR-371-3和miR-367可用于高危人群的篩查，例如性發(fā)育障礙(disorders of sex development，DSD)的患者。另外一項(xiàng)報(bào)告顯示，如果血清中可以檢測(cè)到過(guò)表達(dá)的miR-371-373和miR-302，提示患有睪丸生殖細(xì)胞腫瘤[18]。Murray等分析8例睪丸生殖細(xì)胞瘤后發(fā)現(xiàn)，其血清miR-372和miR-367水平在診斷時(shí)普遍發(fā)生升高，并且血清miR-372和miR-367水平還與腫瘤總體積有關(guān)[17]。

最近有一項(xiàng)令人興奮的發(fā)現(xiàn)，那就是根據(jù)不同的miRNA表達(dá)譜，可以區(qū)別不同的睪丸癌亞型，例如miR-122a只在卵黃囊瘤中表達(dá)。miR-371-373和miR-302a-d簇在精原細(xì)胞瘤中上調(diào)，但仍低于正常睪丸組織中的水平，可以被用來(lái)鑒別畸胎瘤、胚胎細(xì)胞癌以及卵巢內(nèi)胚層竇瘤[19]。

3治療、預(yù)測(cè)治療反應(yīng)性與監(jiān)測(cè)

臨床上對(duì)睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的治療與監(jiān)測(cè)，是基于血清生物標(biāo)志物的檢測(cè)之上。然而，僅有不到60%的患者的AFP(a-fetoprotein/甲胎蛋白)、hCG(human chorionic gonadotropin/人絨毛膜促性腺激素)和LDH(lactatec dehydrogenase/乳酸脫氫酶)升高[20]。miRNA在體液內(nèi)高度穩(wěn)定，并且有些miRNA在腫瘤組織內(nèi)大量表達(dá)。在一項(xiàng)包括24例睪丸癌患者(20例為Ⅰ期，另外4例為Ⅱ或Ⅲ期)的臨床試驗(yàn)中，抽取患者在治療前和治療后的血液標(biāo)本進(jìn)行分析，顯示所有患者的血清miR-371a-3p、miR-372、miR-373-3p水平明顯高于健康對(duì)照(17例)。在Ⅰ期睪丸癌患者中，3種血清miRNA水平在術(shù)后顯著降低，低于正常水平。而在Ⅱ或Ⅲ期患者，血清miRNA水平在治療結(jié)束后回歸到正常水平[21]。另一項(xiàng)研究，11例患者均為Ⅰ期睪丸癌(6例精原細(xì)胞瘤，5例非精原細(xì)胞瘤，平均年齡35歲)，對(duì)照組為12名健康男性(平均年齡36歲)，檢測(cè)患者在睪丸切除術(shù)之前和術(shù)后5天的血清miRNA水平，術(shù)前和術(shù)后的miRNA水平比較采用雙側(cè)Mann-Whitney U檢驗(yàn)，結(jié)果顯示睪丸癌組術(shù)前miR-371-3水平顯著高于對(duì)照組，睪丸癌組術(shù)后的miR-371、miR-372、miR-373水平分別為術(shù)前的1/304、1/24、1/13(P<0.01)[22]。

順鉑是治療睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的常用化療藥物，然而在化療結(jié)束后，順鉑的毒性還會(huì)持續(xù)很長(zhǎng)一段時(shí)間，無(wú)疑降低了患者的生活質(zhì)量。癌細(xì)胞的miRNA可以影響其對(duì)化療的反應(yīng)性，調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。在一項(xiàng)研究中，研究者評(píng)估NT2細(xì)胞(睪丸生殖細(xì)胞腫瘤細(xì)胞株NTERA-2)[23]的miR-302a對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響。在順鉑處理的NT2細(xì)胞，miR-302a出現(xiàn)了升高。miR-302a的下調(diào)可以增加NT2細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，因?yàn)閙iR-302a的下調(diào)促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的G2/M期阻滯，從而加速細(xì)胞凋亡。miR-302a還通過(guò)降低凋亡臨界值而提高順鉑的殺傷效果。并且，這種效應(yīng)在另外一種睪丸生殖細(xì)胞腫瘤細(xì)胞株NCCIT中也可以見(jiàn)到。此外，miR-302a還可以下調(diào)NT2細(xì)胞中p21的表達(dá)，從而提高細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。miR-302a介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，還可以通過(guò)p53沉默而得到進(jìn)一步加強(qiáng)。因此，miR-302a可以為睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的治療干預(yù)提供一個(gè)新選擇[24]。另一個(gè)研究通過(guò)上調(diào)miR-383、抑制蛋白磷酸酶1和調(diào)節(jié)亞基10(PNUTS)的表達(dá)，顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)NT2細(xì)胞造成的DNA損傷，這可能是因?yàn)閙iR-383影響H2AX基因的磷酸化[25]。通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-372和miR-373到人類(lèi)原生細(xì)胞，可以抑制致癌基因Rasv12調(diào)控的細(xì)胞增殖，可用來(lái)開(kāi)辟新的治療方法。

4預(yù)后及隨訪

評(píng)判生育能力的常用方法是精子質(zhì)量分析和檢測(cè)血清激素水平，但這些手段的評(píng)價(jià)尺度不一，并且對(duì)睪丸的某些微小但意義重大的變化不敏感[26]。在動(dòng)物模型中敏感性很高的組織病理學(xué)檢查方法，目前受限于各方面的條件而不能用于臨床[27]。因此，亟需發(fā)掘?qū)ΣG丸損傷敏感的生物標(biāo)志物，以監(jiān)測(cè)生育功能，尤其是在進(jìn)行生殖腺毒性化療之后。成熟的精子含有miRNA，異常的miRNA與少精癥和無(wú)精癥有關(guān)，提示miRNA對(duì)于精子發(fā)揮正常功能很重要[28]。有學(xué)者認(rèn)為，精子遞送到卵子的miRNA在正常的胚胎發(fā)育中能發(fā)揮作用[29]。

對(duì)睪丸癌患者其睪丸切除術(shù)之前和之后的miRNA水平進(jìn)行分析，提示miRNA可能具有預(yù)測(cè)預(yù)后價(jià)值。相比正常對(duì)照，所有睪丸切除術(shù)之后的血清標(biāo)本中的miRNA水平?jīng)]有差異。目前，有研究正在探索TsmiR在隨訪中的作用。無(wú)論是在成人或是兒童睪丸癌患者，TsmiR都有望成為隨訪的重要工具[30]。

綜上所述，近年來(lái)隨著對(duì)miRNA研究的不斷深入，miRNA在睪丸腫瘤的診斷、治療及檢測(cè)中，可以同時(shí)具有高特異性和高敏感性，并易于檢測(cè)。雖然目前的研究表明miRNA有美好的前景，但無(wú)疑還需要經(jīng)過(guò)大量的研究才能證實(shí)。

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(編輯：甘艷)

(收稿日期2015-04-20修回日期 2015-08-24)

文章編號(hào)：1001-5930(2016)04-0694-03

中圖分類(lèi)號(hào)：R737.21

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.04.056

通訊作者：錢(qián)輝軍