文萍　戴希?！⒌ぁ∮嗔贾?（江西省中醫(yī)藥研究院　南昌330046；江西省撫州市食品藥品檢驗所　江西撫州344000）

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蜂膠質(zhì)量控制技術(shù)研究*

文萍1戴希希2劉丹1余良忠1#
（1江西省中醫(yī)藥研究院南昌330046；2江西省撫州市食品藥品檢驗所江西撫州344000）

摘要：目的：建立蜂膠的質(zhì)量控制方法。方法：對蜂膠的性狀、干燥失重、總灰分、酸不溶性灰分、氧化時間、乙醇浸出物含量、有毒有害物質(zhì)等進行檢查，采用薄層鑒別對蜂膠進行特征性鑒別，并對蜂膠中總黃酮的含量測定方法進行方法學研究。結(jié)果：確定了蜂膠各項指標的標準限量；建立了蜂膠總黃酮含量測定的方法，并測定了15批蜂膠中總黃酮的含量，確定了含量范圍。結(jié)論：該方法簡便、可靠，可用于蜂膠的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：蜂膠；總黃酮；質(zhì)量控制

蜂膠是蜜蜂采集植物樹脂等分泌物與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合，形成的膠粘性物質(zhì)。蜂膠的化學成分復(fù)雜，藥理作用廣泛，已經(jīng)成為保健食品研究領(lǐng)域的熱點，是常用的保健食品原料，已收載于中國藥典2010年版。其功能為補虛弱，化濁脂，止消渴；外用解毒消腫，收斂生肌[1～3]，用于抗菌消炎、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、加速組織愈合、高脂血癥和糖尿病的輔助治療[4～6]，但蜂膠尚無保健食品原料質(zhì)量控制技術(shù)標準。本課題組前期對蜂膠提取物制備工藝進行了研究[7]，同時收集到有關(guān)部門頒布的9個蜂膠的相關(guān)標準，這些標準主要還是從蜂膠提取物的形態(tài)、色澤、氣味、滋味、總黃酮含量、氧化時間、乙醇浸出物等指標來控制蜂膠提取物的質(zhì)量，對蜂膠質(zhì)量控制起到了一定作用，但是僅具有感官和理化指標要求是不夠的，缺少特征鑒別和特征成分的含量檢測指標，無法檢測出真假，嚴重影響蜂膠產(chǎn)品的安全性和有效性。本課題組在全國范圍內(nèi)采（收）集了160多批次合格或不合格的蜂膠原料樣品，及楊樹膠和造假主要原料楊樹芽，通過對樣品性狀、干燥失重、總灰分、酸不溶性灰分、氧化時間、乙醇浸出物及有毒有害物質(zhì)的檢查，薄層鑒別和含量測定的方法的研究及確定，為蜂膠的質(zhì)量控制提供了科學的依據(jù)。

1　儀器、試藥及試樣

1.1儀器UV-2450紫外分光光度計（日本島津）；TU-1800SPC型紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；CQ-250超聲波清洗器（上海船舶電子設(shè)備研究所）；AG135雙量程十萬分之一電子天平（Mettller Tkledo公司）；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）。

1.2試藥乙醇、苯、甲醇、磷酸、石油醚（B.P60～90℃）、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲酸（均為分析純）；CG-161M美國AMBERCHROM色譜樹脂（北京春達科技有限公司），聚酰胺薄膜10×20 cm（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）；硅膠G高效薄層板（青島海洋化工有限公司）。

1.3試樣

1.3.1對照品白楊素對照品（批號：111701-200501），高良姜素對照品（批號：111699-200501），喬松素對照品（批號：100080-200707），蘆丁對照品（批號：100080-200707），均由中國藥品生物制品檢定研究院提供。

1.3.2樣品蜂膠為本課題組收集，產(chǎn)地為云南（樣品編號16、17）、四川（編號35、37、38）、江西（編號90、99、103，104，106）、湖南（編號111，117，119）、山東（編號128、129）、河南（編號27、43，45，47）、山西（編號50、52、57）、內(nèi)蒙（編號130、134、136）、遼寧（編號138）、陜西（編號2、4）、甘肅（編號10、15）、新疆（編號31）、浙江（編號86、87、88、89）等地，經(jīng)江西省中醫(yī)藥研究院余良忠研究員鑒定為蜜蜂采集植物樹脂等分泌物與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的膠粘性物質(zhì)。楊樹膠（編號58、59、62、63、64、65、66、153～159）購于河南。巴西蜂膠（編號91號）、烏拉圭蜂膠由江西汪氏蜜蜂園有限公司提供。

2　方法及結(jié)果

2.1蜂膠性狀根據(jù)95批次樣品的觀察結(jié)果、口嘗滋味、鼻嗅氣味，再將樣品至烘箱中加熱至30℃以上，觀察其是否軟化。結(jié)合國標（GBT 24283-2009）蜂膠標準，蜂膠性狀定為：團塊狀或不規(guī)則碎塊，呈棕黃色、棕褐色、青綠色或灰褐色，具光澤，10℃以下質(zhì)脆，30℃以上逐漸變軟，氣芳香，無異味，味微苦，略澀，有辛辣和微麻感。

2.2一般檢查按照中國藥典2010年版一部蜂膠氧化時間規(guī)定項下的方法和附錄ⅨG、ⅨK進行操作，通過對不同批次蜂膠樣品的測定比較，規(guī)定蜂膠干燥失重不得過4.0%、總灰分不得過8.0%、酸不溶性灰分不得過6.0%、氧化時間不得過22 s。

2.3乙醇浸出物含量按中國藥典2010年版一部附錄ⅩA浸出物測定法，對不同批次的蜂膠樣品進行測定。結(jié)果，合格蜂膠醇浸出物含量在40.50% ～66.60%，不合格蜂膠醇浸出物含量在13.70%～ 39.20%。不合格蜂膠浸出物含量低的原因是多方面的，主要原因為蜂蠟多，其次為雜質(zhì)。中國藥典2010年版一部蜂膠項下規(guī)定，醇浸出物含量不得少于50%，根據(jù)江西汪氏蜂蜜園有限公司近幾年大生產(chǎn)提取數(shù)據(jù)和本課題組浸出物測定數(shù)據(jù)表明，合格蜂膠乙醇浸出物大多在40～50%之間，因此，為充分利用資源，規(guī)定蜂膠醇浸出物含量≥40.0%。

2.4蜂膠薄層鑒別取蜂膠樣品100 mg，加甲醇10 ml，超聲提取15 min，作為供試品溶液；另取蜂膠對照藥材0.1 g（取87號蜂膠作為對照），同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版附錄ⅥB）試驗，吸取上述二種溶液各1 μl，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以丙酮∶水∶甲酸（5∶5∶1）為展開劑，40℃展開，取出，晾干，置紫外光（365 nm）下檢視。楊樹膠157、158、159、自提楊樹芽膠95和楊樹膠153～156，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，斑點均不相同，可以判斷為假蜂膠或楊樹芽膠，其余供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，特征斑點Rf值適中。此方法可以用于鑒別蜂膠真?zhèn)巍?/p>

2.5有毒有害物質(zhì)限量

2.5.1鉛、砷、汞分別按GB5009.12、GB/T5009. 11、GB/T5009.17規(guī)定的方法測定，結(jié)果顯示，不同批次的樣品重金屬鉛含量測定結(jié)果相差較大，鉛含量實測值在0.75～22.10 mg/kg，砷含量實測值在0.13～0.71 mg/kg之間，汞未檢出。根據(jù)實測結(jié)果及日本《保健食品原料手冊》中蜂膠乙醇提取液、蜂膠粉末制品的規(guī)定，Pb≤20 mg/kg，最終標準規(guī)定蜂膠鉛含量≤20 mg/kg，砷含量≤1.0 mg/kg，汞參照無公害蜂膠標準NY5136-2002制定，含量≤0.3 mg/kg。2.5.2六六六、滴滴涕按GB/T5009.19規(guī)定的方法測定，結(jié)果不同批次蜂膠中有毒有害物質(zhì)六六六、滴滴涕均未檢出。限度參照無公害蜂膠標準NY5136-2002制定，規(guī)定六六六、滴滴涕含量均為≤0.05 mg/kg。

2.6蜂膠總黃酮含量測定方法的研究[8～9]

2.6.1溶液的配制取蜂膠粉末約0.1 g，精密稱定，置100 ml量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15 min，取出，放置至室溫，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取1 ml，置50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。取喬松素對照品約20 mg，精密稱定，置50 ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 ml，置100 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.6.2方法學考察取蜂膠粉末約0.1 g，按照2.6.1項下同法制備供試品溶液，吸取樣品溶液2 ml，以甲醇為空白，照紫外-可見分光光度法（中國藥典2010年版一部附錄ⅤA）操作，在290 nm處測定吸光度，并對精密度、溶液穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率進行考察。結(jié)果精密度平均值為0.356，RSD=0.11%；溶液穩(wěn)定性平均值為0.361，RSD=1.19%、重復(fù)性平均值為25.04%（總黃酮含量），RSD=0.84%、平均回收率為99.67%，RSD=0.77%（n=6），說明本方法準確性好。

2.6.3樣品測定按照2.6.1項下同法配制供試品溶液和對照品溶液。分別吸取樣品溶液和對照品溶液2 ml，以甲醇為空白對照，照紫外-可見分光光度法（中國藥典2010年版一部附錄ⅤA）依法在290 nm處測定吸光度，計算。結(jié)果顯示，不同批次合格蜂膠中總黃酮含量在18.63%～47.36%之間，不合格蜂膠中總黃酮含量在6.07～22.59%，楊樹芽及其提取物中總黃酮含量在1.25～24.15%。根據(jù)測定結(jié)果，合格蜂膠中只有9號蜂膠中總黃酮含量為19.66% 和117號蜂膠中總黃酮含量為18.63%，＜20.0%，其它批次蜂膠中總黃酮含量均＞20.0%，最終規(guī)定蜂膠中總黃酮含量（以喬松素計）應(yīng)不得少于20.0%。

3　討論

本文利用現(xiàn)代的薄層色譜技術(shù)，確定蜂膠以及蜂膠提取物中的專屬性薄層色譜，方法簡便易行，為真?zhèn)畏淠z的鑒別提供依據(jù)。通過多批次蜂膠的性狀、一般性檢查等實驗研究把合格蜂膠定義為：團塊狀或不規(guī)則碎塊，呈棕黃色、棕褐色、青綠色或灰褐色，具光澤，10℃以下質(zhì)脆，30℃以上逐漸變軟，氣芳香，無異味，味微苦，略澀，有辛辣和微麻感。蜂膠干燥失重不得過4.0%、總灰分不得過8.0%、酸不溶性灰分不得過6.0%、氧化時間不得過22 s。蜂膠醇浸出物含量≥40.0%，鉛含量≤20 mg/kg，砷含量≤1.0 mg/kg，汞含量≤0.3 mg/kg，六六六、滴滴涕含量均為≤0.05 mg/kg，蜂膠中總黃酮含量（以喬松素計）應(yīng)不得少于20.0%。利用先進的分析手段對蜂膠進行檢測，建立了系統(tǒng)、全面、科學的質(zhì)量控制技術(shù)，確保蜂膠質(zhì)量穩(wěn)定可控，規(guī)范蜂膠的市場秩序。

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Research of the Quality Control for Propolis

WEN Ping1, Dai Xi-xi2, LIU Dan1, YU Liang-zhong1#
(1Jiangxi Traditional Chinese Medicine Institute, Nanchang330046; 2Food and Drug Inspection Institute of Fuzhou City, Fuzhou344000)

Abstract:Objective: To establish the quality control method for propolis. Methods: Checked the characters, loss on drying, total ash, acid insoluble ash, oxidation time, ethanol extract content determination, toxic and harmful substances of the propolis, used TLC to identify the characteristics of propolis, and studied the content determination method of total flavonoids in propolis. Results: The standard limit of each index of propolis was determined. The content determination method of total flavonoids in propolis was established, and by the determination of the content of total flavonoids in the 15 batches of propolis, the range of content was determined. Conclusion: the method is simple, reliable and can be used for the quality control of propolis.

Key words:Propolis; Quality control; Total flavone

*基金項目：江西省科技計劃項目（編號：20141BBG70075）

#通訊作者：余良忠，E-mail：ylz@sohu.com

中圖分類號：R282.5

文獻標識碼：B

doi:10.13638/j.issn.1671-4040.2016.02.044

收稿日期：（2015-12-28）