楊　柳,胡文忠,*,姜愛麗,馮　可,2,王　馨

(1.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600;2.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連 116024)

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分子生物學(xué)方法檢測沙門氏菌的研究進(jìn)展

楊柳1,胡文忠1,*,姜愛麗1,馮可1,2,王馨1

(1.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600;2.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連 116024)

沙門氏菌是一種能引起人畜共患病的病原菌,由其引起的食物中毒事件屢居首位,在食品致病菌的檢測中,沙門氏菌的檢測是尤為重要的。本文針對目前檢測食品中的沙門氏菌常用的分子生物學(xué)方法,包括三種PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫技術(shù)和焦磷酸測序技術(shù)進(jìn)行了綜述,對分子生物學(xué)快速檢測技術(shù)與其他學(xué)科技術(shù)的聯(lián)合使用做簡單的介紹,并對這些技術(shù)的未來發(fā)展進(jìn)行展望。

分子生物學(xué),沙門氏菌,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),檢測技術(shù)

沙門氏菌是一種革蘭氏陰性桿菌,菌群的種類眾多,由于沙門氏菌對營養(yǎng)的要求不高,所以其分布很廣泛,是一種能夠引起人和畜患病的病原體。肉類(尤其是禽肉)、海產(chǎn)品、蛋類等許多食品都與沙門氏菌病有關(guān),原因是這些食品中含有的營養(yǎng)成分非常豐富,使沙門氏菌生長繁殖速度快,人類攝入含大量沙門氏菌的食品就會(huì)引起細(xì)菌性感染,進(jìn)而引發(fā)食物中毒[1]。在很多相關(guān)的報(bào)道中指出生肉是沙門氏菌污染的主要食品[2-4]。在我國,每年發(fā)生的細(xì)菌性食物中毒事件中,由沙門氏菌引起的食物中毒屢居首位,約占40%[5]。

沙門氏菌的檢測在食源性致病菌的檢測中處于一個(gè)重要的位置。目前,包括我國在內(nèi)的許多國家對沙門氏菌的檢驗(yàn)普遍采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法,得出檢驗(yàn)結(jié)果大致需4～5 d[6],該方法耗時(shí)長,操作復(fù)雜,無法滿足市場需求。近幾十年來,隨著分子生物學(xué)持續(xù)快速地發(fā)展,分子生物學(xué)方法用于鑒定食源性致病菌的研究也越來越深入,如今多重PCR檢測和在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上研發(fā)試劑盒已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn),在該領(lǐng)域的研究者也傾向于把分子生物學(xué)與微型計(jì)算機(jī)相結(jié)合研發(fā)新的檢測技術(shù),各種生物傳感器檢測致病菌的方法也在不斷地被挖掘。常用于檢測沙門氏菌的分子生物學(xué)方法主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、熒光定量PCR、基因芯片技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等[7-9]。

1　聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)

1.1常規(guī)PCR技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種用于放大擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù),是DNA在體外模擬體內(nèi)進(jìn)行快速復(fù)制的過程。宮強(qiáng)等人[10]根據(jù)鼠傷寒沙門氏菌的ompc基因序列設(shè)計(jì)合成了一對特異性引物對該基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增,最低檢測限達(dá)到了1 pg/μL,減少了實(shí)驗(yàn)成本和實(shí)驗(yàn)時(shí)間。Radhika等[11]用invA基因設(shè)計(jì)一對引物并特異性地檢測出了致病性的沙門氏菌,而在非沙門氏菌中并沒有發(fā)現(xiàn)invA基因。當(dāng)實(shí)驗(yàn)中只有一種基因進(jìn)行檢測的時(shí)候,檢出限相對較低,并且其特異性也很強(qiáng)。武曉松等人[12]建立了應(yīng)用于檢測蔬菜中沙門氏菌的PCR檢測方法,對180份市售蔬菜樣品進(jìn)行檢測,6份樣品檢出沙門氏菌,檢出率為3.33%。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)人員的檢測并將這些實(shí)驗(yàn)方法運(yùn)用于食品的檢測中發(fā)現(xiàn),與傳統(tǒng)的生化檢測方法相比,PCR技術(shù)檢測致病菌更加省時(shí),靈敏度方面也有了很大的提高,但是其成本還是相對較高,而且有假陽性的現(xiàn)象產(chǎn)生。

1.2多重PCR技術(shù)

多重PCR是指在同一個(gè)反應(yīng)體系中,加入與所測目標(biāo)菌對應(yīng)的多對特異性引物,如果能夠得到與這些引物特異性互補(bǔ)的模板,則可同時(shí)在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增出多條目的基因片段。其反應(yīng)原理與常規(guī)PCR一樣,只是所用的引物為多對。李鳳梅等人[13]對沙門氏菌的invA基因、fliC基因和spvR基因設(shè)計(jì)三對特異性引物,建立了一個(gè)同時(shí)檢測雞源致病性沙門氏菌的多重PCR體系,并且得到的檢出限為4.5×102cfu/mL。馮飛等人[14]分別根據(jù)沙門氏菌16S rRNA,質(zhì)粒毒力基因spvC和致病基因 invB、fimA設(shè)計(jì)4對引物對沙門氏菌進(jìn)行檢測,實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過一次增菌,并能實(shí)現(xiàn)12 h內(nèi)在人工污染的食品樣品中檢測出沙門氏菌,且靈敏度達(dá)到了102cfu/mL。閆晗等人[15]以大腸桿菌的phoA基因、金黃色葡萄球菌的nucA基因和沙門氏菌的invA基因?qū)θ橹械倪@三種致病菌進(jìn)行多重PCR實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明多重PCR檢測方法與國家標(biāo)準(zhǔn)中常規(guī)的細(xì)菌學(xué)檢測方法相比在時(shí)間上縮短了12～24 h。研究中,實(shí)驗(yàn)者用多種具有同源性的基因進(jìn)行了測試,實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明了多重PCR大大縮短了檢測時(shí)間,提高了檢測的靈敏度,減少了成本,并且在實(shí)驗(yàn)中對實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化后基因條帶都明顯得到擴(kuò)增而沒有出現(xiàn)雜帶,說明其具有很強(qiáng)的抗干擾性。

多重PCR技術(shù)是在單重PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良優(yōu)化的。常規(guī)的PCR反應(yīng)只檢測一種致病菌,而多重PCR實(shí)現(xiàn)了在同一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測兩種或兩種以上的致病菌。在這樣多種致病菌同時(shí)檢測的情況下,大大減少了檢測所需要的時(shí)間,降低了成本。引物的設(shè)計(jì)對多重PCR實(shí)驗(yàn)成功的影響很大,各引物之間是否設(shè)計(jì)得合理,是否會(huì)造成相互污染是必須考慮的首要問題。食物中的各種成分也會(huì)對實(shí)驗(yàn)的結(jié)果造成不同程度的影響,所以在進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)時(shí),盡量避免人為的污染,以減少實(shí)驗(yàn)誤差。

1.3熒光定量PCR技術(shù)

熒光定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì),利用熒光信號的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR過程,最后通過繪制已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液的標(biāo)準(zhǔn)曲線對被測模板進(jìn)行定量分析的方法。傳統(tǒng)的定量PCR從細(xì)菌的培養(yǎng)到擴(kuò)增再到電泳,這個(gè)過程非常耗時(shí),只能在終點(diǎn)檢測,而實(shí)時(shí)熒光定量PCR不需要加入內(nèi)標(biāo),并有效地解決了傳統(tǒng)定量PCR只能在終點(diǎn)檢測的劣勢?，F(xiàn)今,熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)也發(fā)展到了多重檢測的階段,多重?zé)晒舛縋CR實(shí)驗(yàn)也是國內(nèi)外近年來一直在積極研究的一個(gè)方向。魏瓊[16]選擇沙門氏菌的invA基因、志賀氏菌的ipaH基因和金黃色葡萄球菌的nuc基因進(jìn)行三重?zé)晒舛縋CR實(shí)驗(yàn),其利用建立好的體系直接檢測模擬感染細(xì)菌樣品,最低檢出限為102cfu/g。楊美榮[17]等人將熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用于飼料中沙門氏菌的檢測中,將熒光定量PCR技術(shù)檢測三種樣品的檢測結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果進(jìn)行對比,結(jié)果表明了熒光定量PCR技術(shù)的特異性更強(qiáng),其檢測結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符,能對飼料進(jìn)行有效的檢測,具有省時(shí)省力的特點(diǎn)。與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SNT1059.7-2010[18]中對沙門氏菌增菌液檢測的檢出限240 cfu/mL相比,研究人員對實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明檢出限遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定的檢出限。

與多重PCR檢測技術(shù)相比,熒光定量PCR技術(shù)是菌的擴(kuò)增和檢測做到了一步完成,省去了電泳的過程,更快地得到檢測結(jié)果。而且這個(gè)方法的操作更簡單且自動(dòng)化的程度更高,同時(shí)也不需要后期的處理。與普通PCR技術(shù)相比,該方法人為污染的可能性更低。但是Jacobsen等[19]研究表明,以DNA為基礎(chǔ)的熒光定量PCR不能有效地區(qū)別死菌和活菌,所以這種檢測技術(shù)不適用于含有加熱致死的菌體的樣品,如加工肉制品、即食食品中的沙門氏菌的檢測,比較適用于生鮮食品的檢測。

2　基因芯片技術(shù)

1991年Fodor等人提出了生物芯片的概念[20]?；蛐酒瑢儆谶@其中最早的一種芯片,是指DNA片段經(jīng)過PCR擴(kuò)增之后,將這些基因序列標(biāo)記為未知靶基因序列,將其與集合了大量已知序列探針的基因芯片上特定的基因位點(diǎn)上的探針進(jìn)行雜交,再通過檢測雜交信號來對基因信息進(jìn)行分析[21-22]。基因芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)、植物基因檢測、生命科學(xué)研究、食品研究及檢測等方面應(yīng)用也比較廣泛[23-26]。陳昱等人[27]通過設(shè)計(jì)志賀氏菌ipaH基因、沙門氏菌stn基因和大腸桿菌O157的slt基因的三對特異性引物,用多重PCR技術(shù)和基因芯片技術(shù)相結(jié)合對人工模擬樣品和實(shí)際樣品進(jìn)行檢測,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這兩種方法相互結(jié)合檢測這三種菌的靈敏度都可達(dá)到50 cfu/mL,而多重PCR電泳的檢測的靈敏度為500 cfu/mL。通過對比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)基因芯片技術(shù)不僅在自動(dòng)化的程度上高于PCR技術(shù),其在檢測靈敏度上也相對較高。基因芯片技術(shù)是分子生物學(xué)與計(jì)算機(jī)應(yīng)用的一種融合,只是目前還沒有具體的標(biāo)準(zhǔn)對基因芯片技術(shù)進(jìn)行一個(gè)綜合性的說明。

3　環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)簡稱LAMP技術(shù),是利用具有鏈置換活性的BstDNA 聚合酶,通過識別靶序列上6段特異區(qū)域的2條內(nèi)引物(FIP 和BIP)和2條外引物(F3和B3)在恒溫條件下短時(shí)間內(nèi)催化合成新的鏈,并通過靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生反應(yīng)出現(xiàn)的焦磷酸鎂的白色沉淀來判斷靶基因是否存在[28-30]。田楨干等人[31]運(yùn)用LAMP技術(shù)針對沙門氏菌的agfA基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì),并對54株臨床分離的陽性樣本加以驗(yàn)證,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明分離樣本的符合率達(dá)到100%。LAMP技術(shù)不僅在檢測的準(zhǔn)確率上很高,而且它的靈敏度與普通PCR技術(shù)相比也要高出很多。王潤鑫[32]針對沙門氏菌的invA基因進(jìn)行LAMP引物的改良并檢測,而龐心怡等人[33]用沙門氏菌的特異性基因invA設(shè)計(jì)引物,并用LAMP技術(shù)和PCR技術(shù)對人工污染的樣品和實(shí)際樣品進(jìn)行檢測,他們的結(jié)果表明都表明LAMP技術(shù)的靈敏度可以達(dá)到普通PCR技術(shù)的100倍。相對于其他的實(shí)驗(yàn)方法,LAMP技術(shù)操作更簡單,靈敏度和準(zhǔn)確性更高,而且其所需的儀器和試劑相對于PCR技術(shù)更低,耗時(shí)短[34-35]。

在此基礎(chǔ)之上衍生出了實(shí)時(shí)熒光LAMP技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光LAMP技術(shù)是在LAMP反應(yīng)體系中加入發(fā)光的熒光基團(tuán),利用熒光信號對LAMP反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測,該方法快捷方便、特異性和靈敏度高,并且可以在源頭上控制氣溶膠對反應(yīng)的污染[36]。雖然LAMP技術(shù)一直在改良,但是這一技術(shù)還是存在很多問題。比如在引物上的設(shè)計(jì)它相對于PCR技術(shù)來說要難,而且要篩選出合適的引物還需要大量的工作來驗(yàn)證引物的可靠性,不合理的引物放在同一個(gè)管內(nèi)反應(yīng)出現(xiàn)假陽性的可能性比較大[37]。如今LAMP技術(shù)與實(shí)時(shí)監(jiān)測、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、納米金技術(shù)、電化學(xué)生物傳感器、芯片實(shí)驗(yàn)室等技術(shù)的聯(lián)用,促進(jìn)了LAMP技術(shù)的推廣,通過改良,實(shí)驗(yàn)檢測的過程更簡單、而且自動(dòng)化的程度更高,結(jié)果也更加直觀和準(zhǔn)確,使其在引物設(shè)計(jì)與產(chǎn)物的特異性檢測和分離等方面的缺陷得到了更好的改進(jìn)和發(fā)展,在簡便性、敏感性以及快速性等方面的優(yōu)點(diǎn)更加突出,更加適用于基層和實(shí)地使用[36,38-39]。

4　焦磷酸測序技術(shù)

焦磷酸測序技術(shù)是近年發(fā)展起來的基于分子水平上的一項(xiàng)快速、準(zhǔn)確檢測DNA短序列的微生物檢測技術(shù),并廣泛地應(yīng)用于病毒檢測[40]、微生物檢測[41]和SNP分析[42]等方面。Islam等人[43]使用新一代16s rRNA基因焦磷酸測序技術(shù),發(fā)現(xiàn)了門變形菌門主導(dǎo)OSPW和生物膜,進(jìn)一步深入分析顯示較高豐度的α-和γ-變形菌序列。曹冬梅等人[44]設(shè)計(jì)了測序引物和擴(kuò)增引物對鼠傷寒沙門氏菌的特異性序列進(jìn)行了檢測,該實(shí)驗(yàn)耗時(shí)短,與GenBank中已知的鼠傷寒沙門氏菌DNA序列相比,檢測所得的序列的匹配率為100%。焦磷酸測序技術(shù)做到了將微生物進(jìn)行最本質(zhì)的序列檢測,這樣在很大程度上提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

5　分子生物學(xué)方法檢測致病菌的發(fā)展前景

本文中的快速檢測方法均為研究人員經(jīng)過實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化最終得到了較為理想的結(jié)果,這些分子生物學(xué)快速檢測方法在其最優(yōu)的反應(yīng)和實(shí)驗(yàn)條件下,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了其有檢出限低,檢測時(shí)間與傳統(tǒng)生理生化檢測時(shí)間相比大大減少,靈敏度和準(zhǔn)確率都達(dá)到了一個(gè)理想的水平。目前,致病菌快速檢測的標(biāo)準(zhǔn)基本上均為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)而沒有上升到國家標(biāo)準(zhǔn),只有部分檢測標(biāo)準(zhǔn)說明了在該標(biāo)準(zhǔn)所優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下的檢出限比如SNT1059.7-2010[18]。在檢測標(biāo)準(zhǔn)如GBT13091-2002[45]、SNT2641-2010[46]、SN/T2651-2010[47]等中只對結(jié)果的判定方法進(jìn)行了說明,而沒有對實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確定和抗干擾性等進(jìn)行一個(gè)系統(tǒng)的規(guī)定。

經(jīng)過幾十年的發(fā)展,分子生物學(xué)方法的優(yōu)勢越來越明顯,但是單一的分子生物學(xué)檢測方法檢測沙門氏菌都還存在很多待解決的問題,比如在檢測中如何減少甚至避免假陽性的出現(xiàn)或者通過某一種方法達(dá)到只檢測出活菌而避免,實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性需要進(jìn)一步提高,實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)的人為誤差是造成實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因,所以檢測技術(shù)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化以及計(jì)算機(jī)與分子生物技術(shù)的結(jié)合對未來致病菌的檢測尤為重要。近年來,分子生物學(xué)方法與其他學(xué)期進(jìn)行結(jié)合并對檢測方法不斷地進(jìn)行改良取得了可喜的研究進(jìn)展。比如盛翔宇等人[47]用PCR-HRM方法對32株沙門氏菌的fljB、gyrB和ycfQ 3個(gè)目的基因進(jìn)行分型,其分析正確率為96.9%。金玉娟等人[48]運(yùn)用液相芯片技術(shù)聯(lián)合多重PCR檢測副溶血性弧菌tdh基因、沙門菌inv A基因、單增李斯特氏菌hly A基因和腸出血性大腸埃希氏菌的stx1基因和stx2基因也取得了很好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。沙門氏菌的快速檢測方法在不斷發(fā)展,很多試劑盒在不斷被開發(fā)。比如姜彥君等人[49]根據(jù)沙門氏菌的invA基因、大腸桿菌O157的fliC基因和金黃色葡萄球菌的Nuc基因設(shè)計(jì)特異性引物,建立了一套快速而且能準(zhǔn)確檢測這三種致病菌的試劑盒,這一試劑盒的穩(wěn)定性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、所耗時(shí)間少。目前,國內(nèi)對致病菌的PCR試劑盒的研發(fā)也有很高的關(guān)注,針對沙門氏菌的各種商品試劑盒就有十來種,但是這一技術(shù)相對于國外來說還不是很成熟,所以在試劑盒的建立上還有很大的發(fā)展空間。基于分子生物學(xué)技術(shù)開發(fā)的試劑盒的使用和分子生物學(xué)與其他檢測技術(shù)的聯(lián)合,更簡便、快捷的檢測食品中沙門氏菌的污染情況,各學(xué)科間的相互借鑒對沙門氏菌的快速檢測可能會(huì)成為今后的研究熱點(diǎn)。

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Research progress in molecular biology methods for detection ofSalmonella

YANG Liu1,HU Wen-zhong1,*,JIANG Ai-li1,FENG Ke1,2,WANG Xin1

(College of Life Science,Dalian Nationalities University,Key Laboratory of Biochemical Engineering,The State Ethnic Affairs Commission-Ministry of Education,Dalian 116600,China;2.College of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

Salmonellais a kind of pathogenic bacteria that can cause human and animal diseases,and it is the first place that the food poisoning incidents caused by them.This paper make a simple summary that aim at the methods of molecular biology for the detection ofSalmonellain food,include three PCR technology,gene chip technology,loop mediated isothermal technology and pyrosequencing,to do a simple introduction of rapid testing of molecular biology technology in conjunction with other disciplines,and to prospects for the future development of these technologies.

molecular biology;Salmonella;PCR;detection technology

2015-11-24

楊柳(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：食源性致病菌檢測，E-mail：771084886@qq.com。

胡文忠(1959-)，男，博士，教授，研究方向：采后生物學(xué)與技術(shù)，E-mail：hwz@dlnu.edu.cn。

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD38B05)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172009)；大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012E13SF106)；大連市金州新區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012-A1-049)。

TS207.4

A

1002-0306(2016)09-0372-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.065