鐘芳芳,袁霞,周太光,鄒艷,劉文君

（四川醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒一科，四川瀘州646000）

IL-17A基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性與川崎病易感性的相關(guān)性研究*

鐘芳芳,袁霞,周太光,鄒艷,劉文君

（四川醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒一科，四川瀘州646000）

目的：研究瀘州地區(qū)漢族兒童白細(xì)胞介素-17A（Interleukin 17A，IL-17A）基因多態(tài)性與川崎病易感性及冠脈損傷的關(guān)系。方法：應(yīng)用序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（sequence specific primers-polymerase chain reaotion,SSP-PCR）法檢測(cè)110例瀘州地區(qū)漢族川崎病患兒及125名健康兒童IL-17A基因啟動(dòng)子區(qū)域（-197G/A和-692C/T）的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP），分析川崎病組與對(duì)照組之間以及冠脈損傷組及冠脈未損傷組之間的差異。結(jié)果：IL-17A-197G/A位點(diǎn)川崎病組患兒AA基因型頻率（29.1%）顯著高于對(duì)照組（15.2%）（P=0.015），A等位基因攜帶者罹患川崎病風(fēng)險(xiǎn)是G等位基因攜帶者的1.392倍（95%CI：1.009-1.865，P=0.041）；而IL-17A-692C/T位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布在川崎病組和對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。IL=17A基因啟動(dòng)子區(qū)兩個(gè)位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率分布在川崎病冠脈損傷組和冠脈未損傷組無(wú)顯著差異。結(jié)論：IL-17A基因啟動(dòng)子區(qū)域-197位多態(tài)性與瀘州地區(qū)漢族兒童中川崎病易感性相關(guān)，-197A等位基因攜帶者更易罹患川崎病，而IL-17A-692C/T位點(diǎn)多態(tài)性與該地區(qū)兒童川崎病的易感性無(wú)顯著相關(guān)性。

白細(xì)胞介素-17;單核苷酸多態(tài)性;川崎病;易感性

川崎?。╧awasaki disease，KD）是兒童最常見(jiàn)的自身免疫性血管炎綜合征，其最嚴(yán)重的威脅是冠狀動(dòng)脈損傷（Coronary artery lesions，CAL），在很多國(guó)家和地區(qū)其已成為導(dǎo)致兒童獲得性心臟病的最常見(jiàn)原因[1]。1967年發(fā)現(xiàn)至今，KD病因及發(fā)病機(jī)制仍不清楚，但已有大量的研究支持該病的病因可能與感染引起的炎癥反應(yīng)及免疫紊亂有關(guān)，而宿主的遺傳背景差異影響著其對(duì)KD的易感性[2]。IL-17（通常指IL-17A）是重要的炎癥因子，參與人類各種生理病理變化。目前，已有IL-17A基因啟動(dòng)子區(qū)域-197位（rs2275913）SNP與兒童哮喘、-692位（rs8193036）SNP與潰瘍性結(jié)腸炎等免疫性疾病的易感性相關(guān)的報(bào)道[3-4]。本研究擬用SSP-PCR法檢測(cè)IL-17A基因-197位、-692位的基因型，試闡明其基因多態(tài)性與川崎病易感性及患兒冠狀動(dòng)脈損傷的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究經(jīng)瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入選患兒經(jīng)家屬知情同意。

病例組：應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法選取2013年08月至2014年12月瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院門診隨訪及住院川崎病兒童110例，年齡(2.3±1.1)歲，男∶女1.2∶1。所有病例均符合日本KD診斷標(biāo)準(zhǔn)（2002修訂版，http:// www.kawasaki-disease.org/diagnostic/index.html）。其中川崎病合并冠狀動(dòng)脈損傷（KD-CAL+）包括冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張和冠狀動(dòng)脈瘤，其診斷標(biāo)準(zhǔn)參照的是第七版諸福棠實(shí)用兒科學(xué)[5]。統(tǒng)計(jì)110例川崎病患兒，其中合并冠狀動(dòng)脈損傷（KD-CAL+）46例（41.8%），無(wú)冠狀動(dòng)脈損傷（KD-CAL-）64例（58.2%）。

健康對(duì)照組：應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法選取我院門診健康體檢兒童125例，年齡（3.9±2.5）歲，男∶女為1.3∶1。近期未有發(fā)熱感染病史，并排除腫瘤、自身免疫性疾病、過(guò)敏性疾病病史。

1.2 DNA提取

每例病例組和對(duì)照組研究對(duì)象均采外周靜脈血200 μl（EDTA抗凝）提取人基因組DNA（TianGen Biotech,China）。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)人基因庫(kù)中已知的DNA序列及IL-17A（-197G/A和-692C/T）基因SNP設(shè)計(jì)序列特異性引物（Gene ID:3605）(見(jiàn)表1)。

1.4 SSP-PCR反應(yīng)及產(chǎn)物電泳分析

PCR反應(yīng)體系：特異正向引物F1(或F2)和內(nèi)參正向引物各0.5 μL，通用反向引物1 μL，2 μL DNA，12.5 μL 2×Power Taq Master Mix(BioTeke, China)，用滅菌雙蒸餾水將總體積補(bǔ)充至25 μL。PCR反應(yīng)條件：①IL-17A-197G/A位點(diǎn)：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，50℃退火40 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。②IL-17A-692C/T位點(diǎn)：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，52℃退火40 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。在Mycycler熱循環(huán)儀(Bio-Rad,USA)上完成以上反應(yīng)。

將5 μL PCR產(chǎn)物加入1.5%瓊脂糖凝膠樣孔中，在0.5×TAE緩沖液中設(shè)置電壓110 V室溫電泳35 min后于自動(dòng)凝膠成像儀（Gene Company, UK）上觀察判斷結(jié)果并記錄電泳圖譜（見(jiàn)圖1）。

圖1 IL-17A基因SSP-PCR產(chǎn)物電泳圖

1.5 PCR產(chǎn)物測(cè)序分析

將已初步確定基因型的研究對(duì)象的DNA樣本兩位點(diǎn)各隨機(jī)選取3份用內(nèi)參引物（C,R）PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序分析，以驗(yàn)證SSP-PCR檢測(cè)SNP的可靠性。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析方法

Hardy-Weinbergy遺傳平衡定律對(duì)所有SNP進(jìn)行遺傳平衡檢測(cè)；直接計(jì)數(shù)法計(jì)算兩組人群兩位點(diǎn)基因型及等位基因的頻率，卡方檢驗(yàn)分析組間分布差異，優(yōu)勢(shì)比（odds ratio，OR）評(píng)估相對(duì)危險(xiǎn)度并計(jì)算95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)。以上均應(yīng)用SPSS18.0進(jìn)行分析，P＜0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果

Hardy-Weinbergy遺傳平衡定律檢驗(yàn)川崎病組和對(duì)照組IL-17A-197 G/A，-692 C/T位點(diǎn)的基因型頻率，均達(dá)到遺傳平衡（P＞0.05），說(shuō)明本研究入選對(duì)象有群體代表性。

2.2 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果分析

將經(jīng)SSP-PCR檢測(cè)初步確定基因型的樣本用內(nèi)參擴(kuò)增，其PCR產(chǎn)物正向測(cè)序，所有測(cè)序結(jié)果與IL-17A基因Genebank正常序列和SSP-PCR的檢測(cè)結(jié)果均一致，表明應(yīng)用SSP-PCR法檢測(cè)IL-17A基因SNP是可靠的。

2.3 IL-17A-197G/A、-692C/T位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布分析

在川崎病組和對(duì)照組間，-197G/A位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布有顯著差異，川崎病組AA基因型分布頻率（29.1%）顯著高于對(duì)照組（15.2%），P=0.015，OR=2.427，95%CI為1.291-4.153；川崎病組-197 A等位基因分布頻率（51.4%）顯著高于對(duì)照組（41.6%），P=0.041，OR=1.392，95%CI為1.009-1.865。而-692C/T位點(diǎn)基因型及等位基因分布頻率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05,見(jiàn)表2）。

表2 川崎病組和對(duì)照組IL-17A(-692C/T、-197G/A)基因型和等位基因頻數(shù)分布[例(%)]

2.4 IL-17A基因多態(tài)性與KD合并CAL關(guān)系的探討

IL-17A-197位及-692位基因型及等位基因頻率在發(fā)生冠狀動(dòng)脈損傷和未發(fā)生冠狀動(dòng)脈損傷的川崎病患兒中分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（見(jiàn)表3）。

表3 IL-17A基因型及等位基因在KD-CAL+和KD-CAL-中的分布[例(%)]

3 討論

川崎病是一種主要發(fā)生于5歲以下嬰幼兒全身性血管炎綜合征，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，發(fā)病率卻逐年增高。北京＜5歲兒童發(fā)病率由1995年的18/10萬(wàn)升高到2009年的87/10萬(wàn)，已成為我國(guó)兒科住院的常見(jiàn)病之一[6]。臨床上主要表現(xiàn)為不明原因發(fā)熱5 d以上，皮膚黏膜損害，雙側(cè)非化膿性結(jié)膜炎，肢端硬腫，多形性紅斑以及頸淋巴結(jié)非化膿性腫大。冠脈損傷是KD最大的威脅，急性心力衰竭、冠狀動(dòng)脈瘤破裂等是其主要的死亡原因。醫(yī)學(xué)家和免疫學(xué)家對(duì)川崎病的病因及發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了深入的研究，目前普遍認(rèn)為，感染因素所觸發(fā)的急性炎癥和免疫調(diào)節(jié)紊亂是KD發(fā)生的關(guān)鍵。Th17細(xì)胞是由Park HD等[7]和Harrington LE等[8]分別發(fā)現(xiàn)的一種能夠分泌IL-17的新型CD4+T細(xì)胞亞群，在機(jī)體防御反應(yīng)和自身免疫性疾病中具有重要意義。迄今IL-17家族已IL-17A(通常所指的IL-17)、IL-17B、IL-17C、IL-17 D、IL-17 E(亦被稱為IL-25)和IL-17F[9]等6位成員，其中研究發(fā)現(xiàn)IL-17A、IL-17 E及IL-17 F是重要的致炎癥因子。IL-17可以促進(jìn)多種促炎癥因子如IL-6、IL-1β、TNFα等的分泌，而IL-6能夠正反饋進(jìn)一步促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化和激活急性期炎癥反應(yīng)[10]。已有研究發(fā)現(xiàn)：KD急性期患兒血清及外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)培養(yǎng)上清液中炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNFα等水平顯著升高，其中患兒血清IL-6水平較正常兒童高10倍；急性期患兒產(chǎn)生IL-17的Th17細(xì)胞與血清中IL-6水平均較正常兒童明顯增高，且增高的Th 17細(xì)胞和IL-6水平二者呈正相關(guān)[11]。

本文通過(guò)SSP-PCR檢測(cè)法研究IL-17 A基因-692位點(diǎn)和-197位點(diǎn)多態(tài)性與川崎病易感性及患兒冠脈損傷的關(guān)系。結(jié)果表明：在瀘州地區(qū)漢族兒童中IL-17 A基因存在-197 G/A、-692 C/T多態(tài)性；其中IL-17 A-197位點(diǎn)的基因型在瀘州地區(qū)漢族健康兒童中AG型52.8%，GG型32.0%，AA型15.2%，等位基因以G型（58.4%）最多，與本人在研究生階段檢測(cè)的重慶地區(qū)人群中AG型53.7%，GG型31.3%，AA型15.0%的分布十分接近，而與Nordang GB[12]報(bào)道的在新西蘭人群中AG型47.0%，GG型41.0%，AA型12.0%的數(shù)據(jù)資料有一定差異，可能與種族及地區(qū)不同有關(guān)，也驗(yàn)證了KD的發(fā)病存在明顯的人種和地域的差異；川崎病組與對(duì)照組比較，-197位點(diǎn)AA基因型、A等位基因頻率分布有顯著性差異（P＜0.05），提示IL-17A-197位等位基因A可能是川崎病的易感基因，A等位基因攜帶者比G等位基因攜帶者罹患川崎病的風(fēng)險(xiǎn)高1.392倍。而在本研究中IL-17 A基因-692C/T位點(diǎn)的基因型和等位基因在川崎病組和對(duì)照組分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示-692 C/T位點(diǎn)基因多態(tài)性可能與川崎病的易感性無(wú)顯著相關(guān)性。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，IL-17 A-197位和-692各基因型及等位基因的分布與川崎病冠狀動(dòng)脈損害的發(fā)生無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明兩位點(diǎn)的多態(tài)性與川崎病冠脈動(dòng)脈損害的發(fā)生無(wú)關(guān)。上述的研究發(fā)現(xiàn)與本人在研究生期間所做的關(guān)于重慶地區(qū)漢族兒童IL-17基因多態(tài)性與川崎病易感性的關(guān)系的研究結(jié)果相一致，這與瀘州地區(qū)和重慶地區(qū)同屬西南地區(qū)，且標(biāo)本來(lái)源同為漢族兒童有關(guān)。研究結(jié)果也為明確KD發(fā)病的相關(guān)易感基因生物信息庫(kù)提供數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)KD防治舉措奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，本文研究提示在瀘州地區(qū)漢族兒童中IL-17 A基因-197位多態(tài)性與川崎病易感性相關(guān)，IL-17 A-197 AA基因型更易罹患川崎病。而IL-17 A基因-197位多態(tài)性是否影響IL-17蛋白的表達(dá)及其功能，還需進(jìn)一步的功能學(xué)試驗(yàn)研究。同時(shí)，正如前文所提及的基因多態(tài)性的分布頻率在同地區(qū)不同種族、同種族不同地區(qū)是有所不同，其與疾病的易感性的關(guān)系也可能有差異，故需要在不同地區(qū)、不同種族中進(jìn)行多中心大樣本的研究，才能進(jìn)一步揭示IL-17 A基因多態(tài)性與川崎病易感性及患兒冠脈損傷的關(guān)系。

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（2015-10-11收稿）

Association analysis between polymorphisms of interleukin 17A gene promoter and susceptibility to kawasaki disease

Zhong Fangfang,Yuan Xia,Zhou Taiguang,Zou Yan,Liu Wenjun
Department of Pediatrics,the Affiliated Hospital of Sichuan Medical University,Luzhou 646000,Sichuan Province,China

Objective：To investigate the association between susceptibility to Kawasaki disease(KD)and polymorphisms of interleukin 17A(IL-17A)gene promoter in children of Han Chinese in Luzhou,Sichuan,China.Methods：Using the sequence specific primers-polymerase chain reaction(SSP-PCR)to detect and compare the differences between single nucleotide polymorphisms of IL-17A promoter(-197G/A,-692C/T)in 110 patients with KD and 125 healthy children as control subjects.Results：The frequency of AA genotype at-197G/A in IL-17A in KD patients(29.1%)was significantly higher than that in controls(15.2%)(P＜0.05),and children with A allele were 1.392 times more likely to suffer from KD than children with G allele(95%confidence interval 1.009～1.865,P＜0.05).However,there were no statistic differences in frequencies of genotype and allele at-692C/T in IL-17A between patients and controls(P＞0.05).Moreover，there were no significant differences in frequencies of genotype and allele between the KD-CAL+and KD-CAL-in IL-17A（-197G/A、-692C/T）(P＞0.05).Conclusion：Polymorphism of IL-17A promoter at position-197 is related to susceptibility of KD in children of Han Chinese,with-197A allele was more vulnerable to KD.There was no significant correlation between SNPs at-692C/T in IL-17A promoter and susceptibility to KD.

Interleukin-17(IL-17);Single nucleotide polymorphism(SNP);Kawasaki disease(KD);Susceptibility

R725.6；R-33

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.01.009

*四川省瀘州市科科技局創(chuàng)新苗子基金（項(xiàng)目編號(hào)：2014-R-52（13120））

鐘芳芳（1986-），女，醫(yī)師，碩士，E-mail：597401017@qq.com