韓知峽，陳羿，崔琰，張春蓮，張青碧

(1四川醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院環(huán)境衛(wèi)生與勞動衛(wèi)生教研室，四川瀘州646000；2四川省都江堰市疾病預防控制中心)

MC-LR對雌性小鼠動情周期和血清性激素水平的影響*

韓知峽1，陳羿2，崔琰1，張春蓮1，張青碧1

(1四川醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院環(huán)境衛(wèi)生與勞動衛(wèi)生教研室，四川瀘州646000；2四川省都江堰市疾病預防控制中心)

目的：觀察微囊藻毒素-LR(MC-LR)對雌性小鼠動情周期和血清性激素水平的影響，為闡明MC-LR的生殖毒性提供依據。方法：雌性5周齡昆明小鼠80只，按隨機法分為4組：生理鹽水對照組，MC-LR低劑量染毒組（5 μg/kg）、MC-LR中劑量染毒組（10 μg/kg）、MC-LR高劑量染毒組（15 μg/kg），每組20只，采用腹腔注射方法染毒，每日一次，連續(xù)染毒15d。檢測小鼠的動情周期，血清雌激素（E2）、孕激素（P）、促卵泡激素(FSH)、促黃體生成素(LH)等激素水平的變化。結果：與生理鹽水對照組相比，MC-LR中、高劑量染毒組小鼠動情間期及動情周期延長，血清E2、P激素水平降低，LH、FSH激素水平上升，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論：MC-LR干擾雌激素和孕激素分泌，使動情周期紊亂，具有一定程度的生殖毒性。。

MC-LR；動情周期；雌激素；孕激素

近年來，淡水屢屢出現富營養(yǎng)化和藍藻爆發(fā)現象，其中藍藻水華產生的微囊藻毒素（Microcystins， MCs)污染分布最廣、頻率最高、危害也最嚴重。MCs主要為由藍藻微囊藻、魚腥藻、顫藻和念珠藻等產生的次級代謝物[1]。其中研究比較深入的亞型是MC-LR。經飲水途徑接觸被MC-LR污染的水是人群MCs暴露的最主要途徑[2]，但常規(guī)飲用水處理工藝和煮沸均不能完全去除MCs[3]。關于MCs的研究以往多集中于其在肝臟的累積和毒作用機制[4]，現在有學者發(fā)現性腺是僅次于肝臟的第2個靶器官[5]，并且MCs可以在性腺中轉運和蓄積[6]，引起了學術界對MCs的生殖發(fā)育毒性的關注。本研究試以雌性小鼠為研究對象，探究MC-LR對雌性小鼠動情周期和血清性激素水平的影響，為闡明MC-LR的生殖毒性提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級5周齡昆明種雌性未交配小鼠，體重(20±2)g，由四川醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號SYXK（川）2013-065。

1.2 主要試劑與儀器

MC-LR標準品（瑞士Alexis公司）相對分子質量為995.2，純度95%；蘇木素-伊紅（HE）染液（南京建成生物工程研究所）；雌二醇（E2）、孕激素（P）、促黃體生成素（LH）、促卵泡刺激素（FSH）熒光磁微粒酶免法檢測試劑盒（日本Tosoh corporation）。全自動酶免疫測定裝置AIA1800（日本東曹株式會社）。

1.3 動物分組及處理方法

實驗小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，選取生理周期規(guī)律且處于動情期的健康雌性小鼠80只，按隨機法分為4組：生理鹽水對照組；MC-LR低劑量染毒組（5 μg/ kg）；MC-LR中劑量染毒組（10 μg/kg），MC-LR高劑量染毒組（15 μg/kg），每組20只。在屏障環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，室溫（22±2）℃，濕度50%～70%，光照12 h/ d。動物自由攝食和飲水。用腹腔注射方法染毒，每晨一次，染毒后暴露小鼠陰道，用蘸有少許生理鹽水的無菌小棉簽在陰道側壁處輕輕刮取分泌物少許，薄而均勻地涂于玻片上，用95%乙醇固定，HE染色后顯微鏡下觀察，以判定動情，持續(xù)15 d。實驗第15 d將處于非動情期的小鼠斷頭取血，用以檢測血清E2、P、LH、FSH等激素水平的變化，實驗方法及操作程序均按說明書步驟進行。取血后，進行大體解剖觀察，剖取卵巢，稱重并記錄。

動情周期可分為4個階段，分別是動情前期、動情期、動情后期與動情間期[7]。動情周期判斷標準[8]：動情前期涂片可見大量有核上皮細胞、少量角化上皮細胞；動情期滿視野角化細胞；動情后期可見角化上皮細胞及白細胞；動情間期可見大量白細胞及少量黏液。

1.4 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 MC-LR對雌性小鼠動情周期的影響

結果顯示：MC-LR對小鼠動情周期的影響在第10 d和14 d差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表1）。與生理鹽水對照組相比，MC-LR中、高劑量染毒組均能觀察到雌性小鼠動情周期延長（P＜0.001）及動情間期延長（P＜0.05，見表2）。

表1 MC-LR對雌性小鼠動情期的影響（n=20）

表2 MC-LR對雌性小鼠動情周期的影響（n=20）

2.2 MC-LR對雌性小鼠血清E2和P激素水平的影響

與生理鹽水對照組相比，MC-LR低劑量、中劑量和高劑量染毒組均能顯著抑制血清E2、P激素水平（P＜0.001，見表3）。

表3 MC-LR對雌性小鼠E2、P激素水平的影響（n=10）

2.3 MC-LR對雌性小鼠血清FSH和LH激素水平的影響

與生理鹽水對照組相比，MC-LR低劑量染毒組能顯著升高LH激素水平（P＜0.001），FSH激素水平沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。MC-LR中、高劑量染毒組血清LH、FSH激素水平均有上升（P＜0.001，見表4）。

表4 MC-LR對雌性小鼠血清LH、FSH水平的影響（n=10）

3 討論

雌性小鼠在性成熟時會出現動情周期，在動情周期的不同階段，由于受到雌激素、孕激素的影響，陰道黏膜會發(fā)生較典型的周期性變化。雌激素使陰道黏膜細胞增生、角化，孕激素使陰道黏膜細胞加快脫落[8]。因此能通過觀察陰道涂片的細胞學改變，來判斷小鼠動情周期變化是否正常，從而推斷出性腺生殖功能的正常與否。通過觀察小鼠15 d(相當于3個動情周期)的染毒發(fā)現，與生理鹽水對照組相比，MC-LR中、高劑量染毒組均能觀察到雌性小鼠動情間期及動情周期延長。動情前期和后期分別是卵巢排卵和黃體生成分泌孕酮的時期，動情周期的紊亂可能提示MC-LR影響排卵及黃體的形成、分泌和功能的發(fā)揮。

對于雌性動物而言，正常的生殖內分泌功能有賴于完整而又協(xié)調的下丘腦-垂體-卵巢軸神經分泌系統(tǒng)。同時性激素對垂體前葉的分泌是一種反饋調節(jié)。下丘腦的促性腺激素釋放激素促進垂體細胞分泌FSH和LH，FSH促進卵巢的卵泡發(fā)育，LH促進成熟的卵細胞分泌雌激素和孕激素。隨著成熟卵泡細胞增多，顆粒細胞分泌E2的增強，通過反饋途徑抑制垂體的FSH分泌[9]。在排卵后，黃體細胞在分泌雌激素的同時，也會分泌大量的孕激素，孕激素在排卵后5 d～10 d達到高峰，以后逐漸降低。孕激素主要在肝臟降解，然后產生的代謝產物隨尿、糞便排出體外[10]。

通過本實驗發(fā)現，與生理鹽水對照組相比，MCLR低、中、高劑量染毒組血清E2，P激素水平均有下降，差異具有統(tǒng)計學意義。該結果表明MC-LR可能對雌性小鼠卵巢有直接毒性，可影響卵泡發(fā)育及排卵，致血清中E2和P激素呈低水平狀態(tài)。

在本實驗中，染毒組血清FSH水平（MC-LR低劑量染毒組除外）和LH水平明顯高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義，說明MC-LR可能干擾下丘腦-垂體-性腺軸某一環(huán)節(jié)，從而使垂體FSH和LH分泌增多。高水平的FSH和LH可誘導未成熟卵泡過早黃素化，但可能不足以誘導排卵，而導致動情周期紊亂。

1.Neilan BA,Pearson LA,Muenchhoff J,et al.Environmental conditions that influence toxin biosynthesis in cyanobacteria[J].Environmental Microbiology,2013,15(5)：1239–1253.

2.王偉琴，金永堂，吳斌，等.水源水中微囊藻毒素的遺傳毒性與健康風險評價[J].中國環(huán)境科學,2010,30(4)：468-476.

3.吳和巖，鄭力行，蘇瑾，等.上海市供水系統(tǒng)微囊藻毒素LR含量調查[J].衛(wèi)生研究,2005,34(2)：152-154.

4.王昊，徐立紅.微囊藻毒素研究的當前進展和未來方向[J].水生生物學報,2011,35(3)：504-515.

5.Chen J,Xie P,Guo L,et al.Tissue distributions and seasonal dynamics of the hepatotoxic microcystins-LR and-RR in a freshwater snail(Bellamya aeruginosa)from a large shallow,eutrophic lake of the subtropical China.[J]. Environmental Pollution,2005,134(3)：423-430.

6.Zhou Y,Yuan J,Wu J,et al.The Toxic effects of microcystin-LR on rat spermatogonia in vitro[J].Toxicology Letters,2012,212(1)：48–56.

7.王潔，吳素慧，尚海霞.性成熟雌性SD大鼠動情周期的觀察[J].當代醫(yī)學,2013,19(28)：25-26.

8.李靖，李炫誠，吳云霞.確定小鼠動情周期的三種方法[J].實驗動物科學,2007,24(3)：63-64.

9.潘云龍.細胞因子對下丘腦、垂體及靶腺功能的調節(jié)[J].國外醫(yī)學內分泌學分冊，1992，12(3)：126-128.

10.姚泰，吳博威.生理學[M].第6版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：384.

（2015-10-08收稿）

Effect of MC-LR on estrous cycle and levels of serum sexual hormones, estradiol and progesterone in female mouse

Han Zhixia，Chen Yi1，Cui Yan，Zhang ChunLian，Zhang Qingbi
The School of Public Health,Sichuan Medical University，Luzhou 646000，Sichuan Province,China；1Dujiangyan Center for Disease Control and Prevention

Objective：To study the effects of MC-LR on estrous cycle and serum levels of sexual hormones, estradiol and progesterone in female mouse in order to provide experimental evidence for reproductive toxicity of MC-LR.Methods：Eighty female Kuming mice were randomly divided into four groups(20 each).The four groups were control group(saline i.p),low dose MC-LR group(5μg/kg i.p),medium dose MC-LR group(10μg/kg i.p),and high dose MC-LR group(15μg/kg i.p).Mice were given MC-LR once a day for a total of 15 days.The estrous cycle and the levels of estradiol(E2),progesterone(P),Follicle-Stimulating Hormone(FSH),and Luteinizing hormone(LH)were analyzed.Results:After 15 days of treatment,the estrous cycle of medium and high dose groups lasted longer than that of control group(P＜0.05).The level of E2 and P in serum of the medium dose and high dose was significantly lower than that in control group(P＜0.05).The levels of the FSH and LH in serum of the medium and high doses were significantly higher than that in control group(P＜0.05).Conclusion：MC-LR induces toxic effects on reproductive system through prolongation of estrous cycle and inhibition of the secretion of estradiol and progestone.

MC-LR；Estrous cycle；Estradiol；Progesterone

R994.6；R-33

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.01.008

*四川省教育廳基金項目（13ZB0271）,瀘州醫(yī)學院基金項目(2013ZRQN063）

韓知峽（1981-），女，碩士，講師

張青碧（1968-），女，碩士，教授。E-mail:qingbizhang@126.com