王巧稚，韓藝，鄒禮樂，趙宏賢，梅欣明

（四川醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室,四川瀘州646000）

人表皮生長因子基因重組腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定*

王巧稚，韓藝，鄒禮樂，趙宏賢，梅欣明

（四川醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室,四川瀘州646000）

目的：構(gòu)建含人表皮生長因子(human epidermal growth factor,hEGF)基因的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒，為制備表達(dá)EGF基因的重組腺病毒奠定基礎(chǔ)。方法:查找GenBank中hEGF的基因序列，通過化學(xué)方法進行全基因合成得到信號肽+hEGF基因片段，將sp-hEGF基因裝載到pUC57質(zhì)粒，雙酶切后與經(jīng)過同樣處理的腺病毒穿梭質(zhì)粒pYr-ads-6相連，即構(gòu)建成pYr-ads-6-hEGF質(zhì)粒，行雙酶切及測序鑒定。結(jié)果：sp-hEGF成功插入腺病毒穿梭質(zhì)粒pYr-ads-6中，測序鑒定與GenBank中的序列一致。結(jié)論：hEGF重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功。

hEGF，腺病毒，穿梭質(zhì)粒，信號肽

表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)是一種小分子多肽，屬于促生長因子家族成員之一[1]，最早由科恩博士在小鼠頜下腺中提取出，具有刺激細(xì)胞外透明質(zhì)酸和糖蛋白分泌，以及細(xì)胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)的合成，對上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等有較強的促增殖作用[2-3]。表皮生長因子具有明顯的促進損傷修復(fù)的作用,但也有一些缺點：①創(chuàng)面壞死物或炎癥因子會降低EGF對損傷細(xì)胞的修復(fù)效應(yīng)。②生長因子無法在創(chuàng)面局部保持長期有效的濃度。③需多次使用，抬高治療成本。如果能將hEGF基因?qū)胫靖杉?xì)胞,使轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞能持續(xù)分泌生長因子,再協(xié)同脂肪干細(xì)胞多向分化潛能，應(yīng)該能提高創(chuàng)傷修復(fù)速度。因此，本實驗旨在構(gòu)造含人表皮因子基因的重組穿梭質(zhì)粒，為創(chuàng)傷修復(fù)奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和試劑

pYr-ads-6腺病毒穿梭質(zhì)粒購自湖南贏潤生物技術(shù)有限公司。T4 DNA連接酶購自日本Takara公司，限制性內(nèi)切酶均為MBI公司產(chǎn)品，Taq酶、dNTP、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒及Buffer等均來自YRBIO公司，DNA Marker購自北京天根公司。pUC57質(zhì)粒與DH5α菌株由醫(yī)學(xué)實驗中心實驗室保存。

1.2 目的基因的合成

根據(jù)Gene Bank中已知Human cDNA EGF序列，獲得hEGF cDNA全序列（NM_001963），選擇合成EGF基因的信號肽（signal peptide,sp）片段（NM_001963,nt 453-nt 518)加hEGF基因分泌肽片段（NM_001963,nt 3363-nt 3521），sp-hEGF融合基因全長為234 bp，由南京金斯瑞生物科技公司用化學(xué)合成法行全基因合成。Sp-hEGF基因合成時，在上游5，端引入NheI酶切位點,下游3，端引入SalⅠ酶切位點。

1.3 克隆載體pUC 57-hEGF構(gòu)建和鑒定

取sp-hEGF基因片段6 μL,T4DNA連接酶1 μL，pUC 57質(zhì)粒（圖1）1 μL，反應(yīng)體系如下：Buffer緩沖液2.5 μL,ddH2O 14.5 μL,16℃恒溫水浴過夜。取15 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5a[4]中，涂布在含氨芐的培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取較大白色菌落，擴增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，并做NdeⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定。

圖1 pUC57質(zhì)粒圖譜

1.4 穿梭表達(dá)質(zhì)粒pYr-ads-6-hEGF構(gòu)建和鑒定

依次用限制性內(nèi)切酶NdeI、SalI分別酶切克隆質(zhì)粒pUC57-sp-hEGF和腺病毒穿梭質(zhì)粒pYr-ads-6，將酶切后的sp-hEGF基因片段通過T4 DNA連接酶克隆到穿梭質(zhì)粒pYr-ads-6上。反應(yīng)體系為:緩沖液1.5 μL，載體DNA 1μL，目的基因DNA 7 μL,T4 DNA連接酶1 μL，ddH2O 4.5 μL。輕輕混勻后，16℃連接過夜，次日將混合液轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5a細(xì)胞，產(chǎn)物涂布于含卡那霉素的培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。次日挑選平板上較大的白色菌落，在培養(yǎng)基中擴增。按質(zhì)粒提取試劑盒說明，獲得重組質(zhì)粒pYr-ads-6-hEGF。限制性內(nèi)切酶NdeI和SalⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，挑選正確的陽性克隆，送南京金斯瑞生物科技公司測序。

2 結(jié)果

2.1 pUC57-hEGF質(zhì)粒酶切鑒定

pUC57-hEGF質(zhì)粒的陽性克隆經(jīng)Hind III和NdeⅠ雙酶切，切出2.4 Kb載體帶和約540 bp含有sp-hEGF的小帶（圖2）。

圖2 pUC57-hEGF質(zhì)粒酶切圖譜

2.2 pYr-ads-6-sp-hEGF質(zhì)粒酶切鑒定

將sp-hEGF片段亞克隆至pYr-ads-6載體后，所獲陽性克隆經(jīng)NdeⅠ與SalⅠ進行酶切，可切出約650bp的小帶和5.8Kb的大帶。初步推測sp-hEGF基因片段已經(jīng)克隆到pYr-ads-6載體。

圖3 pYr-ads-6-hEGF質(zhì)粒酶切圖譜

圖4 pYr-ads-6-hEG測序比對圖

陽性克隆測序所得的序列和sp-hEGF基因片段進行比對，顯示構(gòu)建序列與預(yù)計堿基序列無差異，提示hEGF腺病毒穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功。

3 討論

要想表達(dá)人表皮生長因子，轉(zhuǎn)入原核質(zhì)粒雖可獲得大量重組蛋白，但原核質(zhì)粒表達(dá)的重組蛋白缺乏相應(yīng)的翻譯后修飾，難以獲得真正意義上的活性蛋白質(zhì)。而在真核表達(dá)體系中，可通過信號肽引導(dǎo)分泌性蛋白質(zhì)到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，經(jīng)修飾后，再經(jīng)高爾基復(fù)合體囊泡運輸可至胞外，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[5-7]?？梢姷鞍踪|(zhì)在向細(xì)胞外分泌的過程中，有賴于信號肽的介導(dǎo)[8]。多個研究證明，信號肽主要功能是調(diào)節(jié)蛋白前體折疊，引導(dǎo)蛋白質(zhì)穿膜運轉(zhuǎn)，對蛋白質(zhì)的分泌有至關(guān)重要的作用[9-10]。

目前獲取目的基因的方法主要有3種：反向轉(zhuǎn)錄法、從細(xì)胞基因組直接分離法和人工化學(xué)合成法。人工化學(xué)合成全基因目前是準(zhǔn)確率最高，速度最快的方法。我們通過檢索NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫獲取人cDNA EGF全基因序列為4875bp，全部用化學(xué)合成難度較大，且片段越大，成功轉(zhuǎn)入質(zhì)粒概率越小。為提高合成基因的成功率和降低后續(xù)插入載體的難度，選取hEGF信號肽加分泌肽基因片段，以使該融合基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能更好的分泌生長因子?，F(xiàn)有研究表明，在不更改氨基酸組成的條件下，DNA序列通過人工合成可提高蛋白表達(dá)量[11]?；蚧瘜W(xué)合成雖然不像PCR那樣能實現(xiàn)迅速高效的擴增，但卻有著不需要模板，直接面向序列等無法替代的優(yōu)勢，可大大縮短制備目的基因的時間[12]。

后續(xù)實驗中，擬將pYr-ads-6-hEGF質(zhì)粒進一步做腺病毒包被，并感染脂肪干細(xì)胞，用于全層皮損的修復(fù)研究，考慮到到干細(xì)胞不易被轉(zhuǎn)染的特點，選擇了腺病毒穿梭質(zhì)粒作為hEGF表達(dá)載體。因腺病毒載體宿主范圍廣，可感染分裂和非分裂細(xì)胞、轉(zhuǎn)染效率高、病毒滴度濃度可控、外源基因裝載容量大等優(yōu)點，已成為基因治療研究中常用的轉(zhuǎn)基因載體[13-14]。本實驗中選擇的pYr-ads-6質(zhì)粒帶有綠色熒光蛋白（GFP）基因，其示蹤作用有助于在后續(xù)試驗中，更好地了解目的基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的位置、擴散范圍和作用時相[15]。

pUC57-hEGF質(zhì)粒若采用克隆位點NheI和SalⅠ酶切，應(yīng)會切出約250 bp的目的基因片段帶和2.7 Kb的大帶。但因250 bp片段條帶不明顯，故換用質(zhì)粒上的Hind III和NdeⅠ進行酶切，得到540 bp小帶與預(yù)測相符。最終將重組穿梭質(zhì)粒pYr-ads-6-hEGF雙酶切后，切出約650 bp的小帶和5.8 Kb的載體帶。所獲目的片段均與預(yù)期相符，初步確定了重組體的正確。進一步通過基因測序?qū)p-hEGF基因序列與Gen-Bank所公布序列行堿基對比分析，兩者一致，證明pYr-ads-6-hEGF腺病毒穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功。

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（2015-10-10收稿）

Constructionandidentificationofarecombinantadenoviralshuttleplasmid expressinghEGFgene

Wang Qiaozhi,Han Yi,Zhou Lile,Zhao Hongxian,Mei Xingming
Department of Histology and Embryology,Sichuan Medical University，Luzhou 646000,SichuanProvince,China

Objective：To construct a recombinant adenoviral shuttle plasmid expressing hEGF gene to deliver hEGF gene effectively.Methods：sp-hEGF cDNA based on the GenBank was chemically synthesized and inserted into the plasmid puc57.The plasmid was digested with NdeI and HindIII,and the double-digested fragment was then cloned into adenoviral shuttle plasmid pYr-ads-6,forming pYr-ads-6-sp-hEGF.The recombinant adenoviral plasmid was verified by double digestion and DNA sequencing.Results：sp-hEGF was successfully synthesized and cloned into adenoviral shuttle plasmid pYr-ads-6.Conclusion：The recombinant adenoviral plasmid carrying hEGF gene is successfully constructed.

hEGF;Adenovirus;Shuttle plasmid；Signal peptide

R329；R-33

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.01.007

*四川省衛(wèi)生廳科研項目（NO:90192）

王巧稚(1978-），女，副教授。E-mail：wqz416@163.com