程俊，曾曉榮，譚曉秋，李鵬云，文靜，毛亮，楊艷

（醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所，四川瀘州646000）

一種有效急性酶分離大鼠心肌細(xì)胞及復(fù)鈣的方法*

程俊，曾曉榮，譚曉秋，李鵬云，文靜，毛亮，楊艷

（醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所，四川瀘州646000）

目的：本研究旨在探討一種既簡(jiǎn)便又高效的急性酶分離大鼠心肌細(xì)胞及有效復(fù)鈣的方法，擬建立一種穩(wěn)定高效分離大鼠心肌細(xì)胞且復(fù)鈣后細(xì)胞成活率高的方法，為進(jìn)一步研究單個(gè)心肌細(xì)胞的各種生理機(jī)制等諸多實(shí)驗(yàn)提供有利的前提保障。方法：應(yīng)用II型膠原酶于Langendorff灌流裝置下進(jìn)行恒壓或恒流灌流，得到橫紋清晰、立體感較強(qiáng)的大鼠心肌細(xì)胞，然后應(yīng)用三步法對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行復(fù)鈣。結(jié)果：應(yīng)用Langendorff灌流系統(tǒng)對(duì)大鼠心臟進(jìn)行恒壓或恒流灌流II型膠原酶，成功得到橫紋清晰、立體感較強(qiáng)的大鼠心肌細(xì)胞，且復(fù)鈣后在臺(tái)式液中存活率仍然高達(dá)50%。結(jié)論：成功建立了一種既簡(jiǎn)便高效又穩(wěn)定的急性分離大鼠心肌細(xì)胞且復(fù)鈣后心肌細(xì)胞成活率較高的方法，為今后研究大鼠心肌細(xì)胞舒縮功能及其基本生理特性提供良好的單個(gè)細(xì)胞。

大鼠；心肌細(xì)胞；Langendorff

急性分離單個(gè)大鼠心肌細(xì)胞常常應(yīng)用于細(xì)胞收縮功能檢測(cè)以及膜片鉗實(shí)驗(yàn)記錄心肌細(xì)胞上的各種通道電流等，但這些檢測(cè)對(duì)單個(gè)心肌細(xì)胞的質(zhì)量要求都非常高。運(yùn)用酶解法分離單個(gè)心肌細(xì)胞時(shí)遇到的最大困擾是分離出的心肌細(xì)胞常常發(fā)生“鈣反常”現(xiàn)象，剛剛分離下來(lái)的心肌細(xì)胞保存在正常臺(tái)式液中恢復(fù)其生理鈣離子濃度時(shí)，常常會(huì)發(fā)生大量皺縮及死亡[1-4]。因此獲得形態(tài)和生理活性良好及耐鈣的心肌細(xì)胞是膜片鉗實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)的目的在于得到一種簡(jiǎn)便而高效的大鼠心肌細(xì)胞分離方法，且復(fù)鈣后耐鈣性好，從而得到用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞狀態(tài)良好且功能較穩(wěn)定的單個(gè)心肌細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象

SD大鼠，雌雄不拘。由四川醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)溶液

1.1.2.1 10×臺(tái)式液（mmol/L）

NaCl 137，HEPES 10，KCl 5.4，MgCl21.2，NaH2PO42，H2O 1.2；pH用NaOH調(diào)至7.40。

1.1.2.2 KB液（mmol/L）

KOH 80，KCl 40，KH2PO425，MgSO43，L-Glutamic 50，Taurine 20，HEPES 10，EGTA 1，D-Glucose 10；pH用KOH調(diào)至7.20[5]。

1.1.2.3 臺(tái)式液（Ca2+-free）

取50 mL 10×臺(tái)式液（無(wú)鈣）加入10 mmol/L葡萄糖，加入去離子水至500 mL。NaOH調(diào)節(jié)pH至7.40。臺(tái)式液和KB液充氧30 min。備用。

1.1.2.4 Buffer A

取上述臺(tái)式液100 mL加10 mmol/L牛磺酸。

1.1.2.5 Buffer E

取30 mL Buffer A，加入15μL 100 mmol/L Ca2+(終濃度50 μmol/L)，加入30 mg小牛血清白蛋白（BSA），再加入24 mgⅡ型膠原酶。

1.1.2.6 Buffer B

取臺(tái)式液（Ca2+-free）50 mL，加入60μL 1 mol/ L Ca2+(終濃度1.2 mmol/L)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1.2.1.1 灌流裝置的清洗

（1）用滅菌水對(duì)整個(gè)灌流系統(tǒng)進(jìn)行清洗。

（2）將恒溫裝置打開，流出液溫度保持在37℃。

（3）打開氣瓶，Buffer A和Buffer E充氧。以Ca2+-free灌流液沖洗灌流裝置，排凈氣泡，并使其充滿整個(gè)裝置，然后切換到Buffer A灌流2 min。灌流速度6 mL/min。

（4）準(zhǔn)備好系心臟的線圈，注射器和血管套管（注射器抽取20 mL臺(tái)式液（Ca2+-free）），以備掛心臟時(shí)用。

1.2.1.2 臺(tái)式液預(yù)冷

用50 mL的離心管取出臺(tái)式液（Ca2+-free）一部分放入-20℃冰箱中預(yù)冷至冰水混合物。

1.2.1.3 準(zhǔn)備大鼠

取一只180～240 g SD大鼠，雌雄不拘，采用腹腔注射0.3 mL/100 g 10%水合氯醛的方法進(jìn)行麻醉。

1.2.2 大鼠心肌細(xì)胞分離

（1）開胸取心臟，置于冰冷的臺(tái)式液（Ca2+-free）灌流液中。去除多余組織。找到主動(dòng)脈。

（2）將主動(dòng)脈套在套管底部。用縫合線扎緊。(從開胸到開始灌流時(shí)間不要超過2 min，恒壓灌流請(qǐng)直接開始第4步)

（3）恒流灌流：①Buffer B灌流約2 min，泵出血污。換Buffer A灌流液灌5 min，使心臟的血液完全排出。正常心臟顏色粉紅。②氧飽和的Buffer E 30 mL循環(huán)灌流。不斷檢查心臟硬度。灌流約30 min后待心臟變得柔軟，終止消化。

（4）恒壓灌流：Buffer A灌流液灌5 min，氧飽和的Buffer E 30 mL循環(huán)灌流。最初灌流消化液時(shí)其速度為20～24 D/10 s（D/10 s，每10 s的滴數(shù)，可用普通輸液器緩沖管計(jì)數(shù)），約2 min后灌流速度減慢，最低時(shí)可達(dá)8 D/10 s，隨后灌流速度逐漸增加，當(dāng)灌流速度重新達(dá)到20～24 D/10 s時(shí)，即可終止循環(huán)消化。

（5）終止消化后，用注射器注射20 mL Buffer A沖洗心臟內(nèi)消化酶。剪下左心室至KB液中，用剪刀剪碎。輕輕吹打細(xì)胞加速分離，100目篩網(wǎng)過濾，吸取上清到離心管中，500 rpm離心40 s，去掉上清。

（6）用KB液重懸細(xì)胞，然后靜置，待細(xì)胞自然沉降6 min，棄去上清，KB液重懸細(xì)胞。室溫靜置。

（7）清洗灌流系統(tǒng)：用超純水200 mL清洗系統(tǒng)，用75%的酒精灌流清洗并充滿灌流系統(tǒng)，保持約30 min，用超純水200 mL清洗系統(tǒng)。

1.2.3 復(fù)鈣

待細(xì)胞KB液中靜置1 h，開始復(fù)鈣。分3次復(fù)鈣，每次讓細(xì)胞自然沉降，棄上清液加入下一濃度的鈣溶液中。

（1）1/3 Ca2+：2 mL Buffer B+4 mL臺(tái)式液（Ca2+-free），放置，10 min。

（2）2/3 Ca2+：4 mL Buffer B+2 mL臺(tái)式液（Ca2+-free），放置6 min。

（3）Buffer B：6 mL Buffer B，放置6 min，棄上清，加Buffer B，靜置備用。

2 結(jié)果

2.1 急性酶分離大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)

運(yùn)用本實(shí)驗(yàn)方法分離出的大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)好、橫紋清晰、邊緣折光性好，初始分離出的心肌細(xì)胞成活率大于80%，見圖1。

2.2 急性酶分離大鼠心肌細(xì)胞復(fù)鈣后的形態(tài)

圖1 應(yīng)用Langendorff灌流系統(tǒng)分離的大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)圖（×200）

應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)方法急性酶分離出的大鼠心肌細(xì)胞經(jīng)過前兩步復(fù)鈣后，細(xì)胞成活率約60%，見圖2。經(jīng)過第三步復(fù)鈣后，耐鈣細(xì)胞高達(dá)50%。見圖3。

圖2 應(yīng)用Langendorff灌流系統(tǒng)分離的大鼠心肌細(xì)胞，經(jīng)過前兩步復(fù)鈣后的形態(tài)圖（×200）

圖3 應(yīng)用Langendorff灌流系統(tǒng)分離的大鼠心肌細(xì)胞，經(jīng)過最后一步復(fù)鈣后的形態(tài)圖（×200）

3 討論

1976年P(guān)owell等[6]首次成功分離出了單個(gè)成熟且耐鈣的心肌細(xì)胞以后，研究者三十多年來(lái)一直在探索怎么提高成熟心肌細(xì)胞的獲得率以及改善心肌細(xì)胞“鈣異?！?。心肌細(xì)胞分離的每一步都對(duì)最終分離的細(xì)胞狀態(tài)產(chǎn)生重要的影響。實(shí)驗(yàn)室溫度、Langendorff裝置設(shè)定溫度、心臟摘取速度、水質(zhì)、溶液pH值、酶的活性及濃度、操作者的熟練程度等都可影響心肌細(xì)胞狀態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)點(diǎn)在于：首先灌流含鈣臺(tái)式液，有利于恢復(fù)心臟的跳動(dòng)，減少心腔內(nèi)的殘存血液；接著灌流無(wú)鈣臺(tái)式液，有利于減弱心肌細(xì)胞間依賴鈣的緊密連接，這些都有利于得到單個(gè)有活性的心肌細(xì)胞。

另外本實(shí)驗(yàn)方法把握分離心肌細(xì)胞時(shí)的終止酶消化時(shí)間也是非常重要的，膠原酶的濃度過高，可造成消化時(shí)間縮短，而酶濃度過低又需要延長(zhǎng)消化時(shí)間，這些都將造成細(xì)胞膜的不可修復(fù)的損害。有報(bào)道認(rèn)為當(dāng)觀察到心臟的顏色變黃，且表面松弛時(shí)立即終止酶消化比較好[7]。但是那樣造成分離下的細(xì)胞較多，但復(fù)鈣后其耐鈣性不好，死細(xì)胞特別多。而我們的經(jīng)驗(yàn)是膠原酶消化到20～30 min時(shí)，觀察到心臟呈現(xiàn)淺白色，且用眼科鑷輕輕夾心臟表面感覺較軟時(shí)，滴下的灌流液中在顯微鏡下可找到單個(gè)的心肌細(xì)胞，這時(shí)終止酶液消化較好。終止酶消化后，在剪碎心肌組織、吹打細(xì)胞等時(shí)動(dòng)作均要輕柔，同時(shí)離心時(shí)間也需要盡量短，以免造成細(xì)胞的再次損害。

由于無(wú)鈣臺(tái)式液灌流造成Ca2+的丟失，為了補(bǔ)償心肌細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)中的Ca2+，我們采用了三步復(fù)鈣法，逐漸遞增復(fù)鈣液中的Ca2+，使心肌細(xì)胞內(nèi)的Ca2+逐漸恢復(fù)正常，鈣存儲(chǔ)達(dá)到其生理濃度，這在后續(xù)的諸多實(shí)驗(yàn)是必須且重要的。

總之，想要得到橫紋清晰、活性良好的單個(gè)心肌細(xì)胞，需要從方方面面注意，其中包括最初的液體配制、灌流系統(tǒng)的清洗、細(xì)胞分離過程中換液體的時(shí)間把握、酶終止時(shí)間的把握、剪碎細(xì)胞動(dòng)作的輕柔、復(fù)鈣等，這些都對(duì)心肌細(xì)胞的生理活性有重要的影響。任何一步的疏忽都會(huì)造成分離的心肌細(xì)胞形態(tài)和活性的變化，最終影響后續(xù)的諸多實(shí)驗(yàn)。

1.Wittenberg BA,Robinson TF.Oxygen requirements, morphology,cell coat and membrane permeability of calcium-tolerant myocytes from hearts of adult rats[J].Cell Tissue Res,1981(2)：231-251.

2.Tytgat J.How to isolate cardiac myocytes[J].Cardiovasc Res, 1994(2)：280-283.

3.Dow JW,Harding NG,Powell T.Isolated cardiac myocytes.Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue[J].Cardiovasc Res，1981(9):483-514.

4.于繼強(qiáng)，高爾，韓慧蓉,等.鈣耐受大鼠心肌細(xì)胞分離方法研究[J].中國(guó)藥房，2009(4)：224-225.

5.石曉璐，柳絮，郭會(huì)彩,等.大鼠心肌細(xì)胞分離方法的改進(jìn)[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26（5）：687-690.

6.Powell T,Twist VW.A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium[J].Biochem Biophys Res Commun,1976,72(1):327-333.

7.Mitra R,Morad M.A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates[J].Am J Physiol,1985,249(5 Pt 2):H1056-1060.

（2015-10-30收稿）

An effective method of acute isolation of cardiomyocytes and calcium recovery in rats

Cheng Jun,Zeng Xiaorong,Tan Xiaoqiu,Li Pengyun,Wen Jing,Mao Liang,Yang Yan
Key Laboratory of Medical Electrophysiology,Sichuan Medical University,Ministry of Education,and Institute of Cardiovascular Research of Sichuan Medical University,Luzhou 646000,Sichuan Province,China

Objective：To establish a simple and efficient method for acute isolation of myocardial cells and effective recovery of calcium in rats,so as to provide a favorable prerequisite protection of cardiomyocytes for further downstream studies of the physiological mechanism of single myocardial cell and many other experiments.Methods：Using type II collagenase in Langendorff irrigation flow device under constant pressure or constant flow perfusion,cardiomyocytes were isolated from rats,followed by a three-step calcium recovery was applied. Results：Cardiomyocytes were successfully isolated from rats using Langendorff irrigation flow system at a constant pressure or constant flow perfusion of collagenase type II,which showed a clear cross striations and strong three-dimensional sense of myocardial cells.After calcium recovery,the survival rate of cardiomyocytes remains as high as 50%in Tyrode solution.Conclusion：A new and high efficient method of acute isolation of cardiomyocytes in rats was established successfully,which can provide functional single cardiomyocyte for further downstream studies.

Rat;Cardionyocyte;Langendorff

R33-33

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.01.004

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No：81173661)，瀘州市-瀘州醫(yī)學(xué)院聯(lián)合專項(xiàng)（2013LZLY-J49）

程俊（1977-），女，副研究員，碩士

楊艷（1962-），女，研究員。E-mail：yangyan65317@163.com