宋麗，孫玉紅，施森

（1四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科；2藥理學(xué)教研室；3附屬醫(yī)院血管外科，四川瀘州646000）

論著

二肽基肽酶-IV介導(dǎo)內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在糖尿病腎纖維化過程中的作用及機制研究*

宋麗1，孫玉紅2，施森3

（1四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科；2藥理學(xué)教研室；3附屬醫(yī)院血管外科，四川瀘州646000）

目的：探討二肽基肽酶-IV在糖尿病腎纖維化中的作用及機制。方法：動物實驗中建立糖尿病CD-1小鼠慢性腎纖維化模型，予以二肽基肽酶-IV抑制劑干預(yù)4周后，檢測正常組、糖尿病組及干預(yù)組中腎臟組織中二肽基肽酶-IV的表達及內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的變化。細(xì)胞實驗中培養(yǎng)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞，分別予以TGFβ2及二肽基肽酶-IV抑制劑或siRNA干預(yù)，觀察各組中二肽基肽酶-IV、內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及TGFβ/smad信號通路的變化。結(jié)果：與正常小鼠相比，糖尿病小鼠腎組織表現(xiàn)出明顯纖維化改變、高表達的二肽基肽酶-IV以及明顯增強的內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；二肽基肽酶-IV抑制劑干預(yù)后腎纖維化及內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化明顯緩解及抑制。細(xì)胞實驗中，二肽基肽酶-IV抑制劑或siRNA能明顯降低TGFβ2誘導(dǎo)的內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及TGFβ/smad信號通路。結(jié)論：二肽基肽酶-IV抑制劑能通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化來改善糖尿病腎纖維化。

二肽基肽酶-IV；糖尿病腎纖維化；內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

腎臟纖維化是腎臟疾病發(fā)展過程中的最終通路，導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)和功能惡化腎臟過濾功能的破壞[1]。腎纖維化是由長期的損傷與細(xì)胞外基質(zhì)的過度積累所導(dǎo)致的正常的傷口愈合過程失調(diào)而引起。在纖維化過程中，腎成纖維細(xì)胞中發(fā)揮重要的作用，但對成纖維細(xì)胞的來源及機制尚不清楚[2]。最新研究發(fā)現(xiàn)在基質(zhì)生產(chǎn)的成纖維細(xì)胞的起源中，內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型（endothelial-to-mesenchymal transition，EndoMT）是肌成纖維細(xì)胞或活化的成纖維細(xì)胞的一個重要來源,EndoMT顯著性標(biāo)志是是由CD31和血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（VE-cadherin）等血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物的丟失和以及α-平滑肌肌動蛋白等間充質(zhì)蛋白的表達增加。研究表明EndoMT參與異常的心室壁收縮能力及心電所導(dǎo)致的心纖維化[3]。EndoMT也參與了肺纖維化，特發(fā)性高血壓，角膜纖維化[4-5]。許多生長因子和信號通路支配調(diào)節(jié)EndoMT在胚胎心臟和心肌的纖維化中的作用。有研究發(fā)現(xiàn)EndoMT也參與早期腎臟纖維化[6]，2008年zeisberge等首次在小鼠模型上證實EndoMT在腎纖維化中的重要作用[7]。關(guān)于其作用機制研究眾多，目前普遍認(rèn)為TGFβ信號通路起到重要作用[8]。

二肽基肽酶-IV（DPP-IV）是T細(xì)胞活化CD26抗原，它廣泛分布于人體器官及組織。DPP-IV能選擇性地切割內(nèi)源性胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）和葡萄糖依賴性促胰島素多肽（GIP）的脯氨酸或丙氨酸，從而降低血糖。由于其分布的廣泛及多效性的作用，DPP-IV抑制劑的使用也能潛在的保護器官，而腎臟是DPP-IV表達最高的器官之一[9]。研究表明，DPP-IV抑制劑能通過抑制TGFβ/smad信號通路改善心衰[10]。

DPP-IV抑制劑是否能通過TGFβ通路改善糖尿病小鼠腎纖維化目前鮮有報道。我們利用糖尿病小鼠慢性腎纖維化模型來設(shè)計本實驗探討DPP-IV抑制劑是否能通過抑制TGFβ/smad信號通路介導(dǎo)EndoMT從而改善糖尿病腎纖維化。

1 材料與方法

1.1 1型糖尿病模型

8周CD1雄性小鼠隨機分為兩組，實驗組腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）200 mg/kg,STZ溶解于pH 4.4的枸櫞酸鈉緩沖液中，對照組注射注射用水。3 d后檢測血糖，高于300 mg/dL確定造模成功。正常飲食飼養(yǎng)小鼠至干預(yù)。

1.2 DPP-IV抑制劑干預(yù)

STZ注射20周后，糖尿病小鼠隨機分為糖尿病組和干預(yù)組，干預(yù)組以DPP-IV抑制劑KR-62436（Sigma）10 mg/kg/day溶于飲用水中。糖尿病組正常飲食。

1.3 標(biāo)本收集

（1）實驗中定時監(jiān)測血糖、體重變化。干預(yù)4周后收集尿液，眼球取血后，取腎組織，分別制成冰凍切片、石蠟切片及部分組織-70℃保存。

（2）測各組尿素、肌酐等腎功能情況。

（3）免疫熒光檢測FSP-1/CD31及α-SMA/CD31，雙染陽性提示處于內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的內(nèi)皮細(xì)胞。

（4）western blot檢測FSP-1、α-SMA、CD31、DPP-IV。

1.4 細(xì)胞實驗

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人微血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于6孔板后，孵育于EGM-2培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合至70%時予以干預(yù)。具體分為3組：對照組，TGF β2(5 ng/mL)組，TGFβ2+ KR-62436(5.7 μM)組。

1.4.2 DPP-IV siRNA轉(zhuǎn)染

培養(yǎng)好的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞分為3組：對照組，TGFβ2組，TGFβ2+DPP-IV siRNA。其中對照組及TGFβ2組細(xì)胞轉(zhuǎn)入對照空白siRNA，TGFβ2+DPPIV siRNA組轉(zhuǎn)入DPP-IV siRNA(ATCGGGAAGTGGCGTGTTCAA),轉(zhuǎn)染前2 h更換無血清無雙抗1640培養(yǎng)液。用無血清無雙抗1640培養(yǎng)液稀釋siRNA和轉(zhuǎn)染試劑lipofectamineTM 2000(Invitrogen,USA),將稀釋液混合,形成siRNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物,將其加入細(xì)胞中,siRNA終濃度為100 nmol/L,6 h后更換為正常培養(yǎng)液，24 h后TGFβ2組及TGFβ2+DPPIV siRNA組予以TGFβ2（5 ng/ml）刺激。

1.4.3 內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型及DPP-IV檢測

48 h后提取蛋白，western blot檢測FSP-1、α-平滑肌細(xì)胞肌動蛋白(α-SMA)、CD31、DPP-IV、smad-3、phospho-smad 3。

1.4.4 遷移實驗

將上述各組細(xì)胞置于遷移小室，觀察48 h后各組細(xì)胞遷移情況。

2 結(jié)果

2.1 小鼠模型

圖1 DPP-IV抑制劑KR-62436干預(yù)后小鼠的體重、血糖、心臟及腎臟重量變化

圖2 DPP-IV抑制劑KR-62436干預(yù)后小鼠腎臟組織學(xué)染色及蛋白肌酐比值

與對照組相比，糖尿病小鼠體重明顯降低，血糖顯著升高，腎臟和肝臟重量明顯增加。與糖尿病小鼠相比，KR-62436干預(yù)后，體重、血糖水平及器官重量（腎，肝，和心臟）均無明顯變化（見圖1A-D）。與對照組小鼠比較，STZ誘導(dǎo)20周后糖尿病小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重纖維化（腎小球明顯增大，間質(zhì)系膜擴張，相對纖維化面積擴張、尿微量白蛋白水平及血肌酐升高）。而KR-62436治療的糖尿病的小鼠恢復(fù)正常的腎臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)及尿微量蛋白水平降低(見圖2A-F、圖3)。

圖3 小鼠蛋白尿肌酐比值圖

2.2 腎組織免疫熒光及Western blot結(jié)果

通過定量分析免疫熒光中共同表達血管內(nèi)皮標(biāo)記CD31和間充質(zhì)標(biāo)記α-SMA的細(xì)胞，糖尿病小鼠腎組織中EndoMT過程的細(xì)胞數(shù)比正常小鼠腎臟明顯增多（見圖4 A-C）。KR-62436治療后雙染陽性細(xì)胞則顯著減少。Western blot也提示與正常腎組織比較，糖尿病小鼠腎組織中DPP-IV、α-SMA、FSP1蛋白表達增加，而CD31則低于正常小鼠。與糖尿病小鼠相比較，KR-62436處理后DPP-IV、α-SMA、FSP1蛋白表達降低，CD31表達增加。這一結(jié)果表明糖尿病腎臟中EndoMT明顯強于正常小鼠腎臟，而DPPIV抑制劑能抑制EndoMT。

圖4 EndoMT在糖尿病腎組織中的表達

2.3 細(xì)胞實驗結(jié)果

HMVEC培養(yǎng)48 h后，與正常組培養(yǎng)相比較，TGFβ2干擾組中，α-SMA、DPP-IV、smad-3及phospho–smad 3蛋白水平明顯增高，KR-62436組蛋白明顯抑制上述蛋白表達。同時我們也可以觀察到KR-62436能顯著提高被TGF β2抑制的CD 31表達。

2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果

細(xì)胞轉(zhuǎn)染DPP-IV siRNA后，DPP-IV水平明顯抑制，α-SMA、TGFβR1及TGFβR 2也明顯降低,而CD 31水平則增加。這表明DPP 4在EndoMT中起著重要作用，而且該作用與TGF/smad信號通路相關(guān)。在細(xì)胞遷徙試驗中可以看到，TGF β2干預(yù)下遷移細(xì)胞較正常組明顯增加，而DPP-IVsiRNA轉(zhuǎn)染后可減少遷移細(xì)胞（見圖5 A-D)。

圖5 DPP-IV抑制劑或siRNA轉(zhuǎn)染后人微血管內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)胞遷移變化

3 討論

糖尿病腎病是目前全世界非常嚴(yán)重及發(fā)病率較高的疾病之一，可發(fā)展成終末期腎臟病，最終需要腎替代療法。腎臟纖維化的程度決定殘余腎功能，因此抑制腎纖維化和恢復(fù)腎的正常結(jié)構(gòu)是研究包括糖尿病腎病在內(nèi)的慢性腎臟疾病的治療目標(biāo)。

研究表明腎成纖維細(xì)胞是EndoMT的重要來源之一，在腎纖維化中占著重要作用[11]。本實驗發(fā)現(xiàn)DPP-IV抑制劑KR-62436是抑制成纖維細(xì)胞活化過程的一個有效的治療方案。腎組織DPP-IV表達最高的器官之一，而DPP-IV抑制劑的使用也能潛在的保護器官[12]，本研究也發(fā)現(xiàn)，與未干預(yù)糖尿病小鼠相比較，我們發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠腎臟DPP-IV蛋白表達明顯增加，免疫組化揭示DPP-IV強表達于腎臟系膜，內(nèi)皮細(xì)胞，腎小管小管。研究發(fā)現(xiàn)DPP-IV抑制劑維格列汀給藥24周能防止STZ誘導(dǎo)的雄性SD糖尿病大鼠腎臟損傷[13]。本實驗利用STZ誘導(dǎo)的一型糖尿病CD1小鼠模型檢測糖尿病誘導(dǎo)20周后KR-62436干預(yù)是否能改善腎臟纖維化。我們發(fā)現(xiàn)，這種干預(yù)在不改變血糖體重等生理基礎(chǔ)的前提下能顯著改善腎纖維化，這說明以DPP-IV為靶向治療糖尿病腎臟是有治療價值的。本實驗免疫組化結(jié)果表明與糖尿病小鼠相比較，DPP-IV抑制劑KR-62436治療的糖尿病的小鼠腎臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)明顯改善，尿微量蛋白水平也明顯降低。DPP-IV抑制劑可通過抑制TGF-β/Smad信號來改善心臟功能，而本實驗也證實DPP-IV抑制劑能抑制TGF-β/Smad信號，這也是其在內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)型中的可能機制。目前對EndoMT和體內(nèi)多種疾病關(guān)系的研究越來越受到人們關(guān)注，對調(diào)控EndoMT的作用機制進行了多方向多層面的探討，未來對內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程更全面更深入的認(rèn)識將有助于為解決多種疾病提供更加有效的診療措施。

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（2015-10-27收稿）

Effect and mechanisms of dipeptidyl peptidase-IV on endothelial-to-mesenchymal transition in diabetic kidney fibrosis

Song Li1,Sun Yuhong2，Shi Sen3
1Deparment of Anesthesiology,the Affiliated Hospital of Sichuan Medical University,2Department of Pharmacy, Sichuan Medical University；3Deparment of Vascular Surgery,the Affiliated Hospital of Sichuan Medical University, Luhzou 646000,Sichuan Province,China

Objective：To analyze the roles and mechanisms of dipeptidyl peptidase-IV（DPP-IV）on endothelial-to-mesenchymal transition in diabetic kidney fibrosis.Methods：Diabetic CD1 mice were used as chronic diabetic kidney fibrosis model.Mice were treated with or without DPP-IV inhibitor for 4 weeks,kidney samples from each groups were used to analyze the pathological changes,DPP-IV protein levels,and endothelialto-mesenchymal transition.In vitro,human microvascular endothelial cells were stimulated with or without TGFβ2,and after treatment with DPP-IV inhibitor or siRNA,cell migration,DPP-IV protein levels,endothelialto-mesenchymal transition,and TGFβ/smad signaling were analyzed.Results:Diabetic CD-1 mice exhibited significant kidney fibrosis and high levels of DPP-IV expression when compared with control mice.DPP-IV inhibitor-treated diabetic mice exhibited a suppression of DPP-IV protein expression and an amelioration of kidney fibrosis associated with the inhibition of EndoMT.In cultured endothelial cells,we found that DPP-IV inhibitor inhibited TGFβ2-induced EndoMT and TGFβ/Smad signaling.Conclusion:DPP-IV inhibitor can ameliorate kidney fibrosis by suppressing EndoMT and TGFβ/Smad signaling.

Dipeptidyl peptidase-IV;Diabetic kidney fibrosis;Endothelial-to-mesenchymal transition

R587.1；R-33

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.01.002

國家自然科學(xué)基金項目（81500643）

宋麗(1980-)，女，碩士，講師

施森(1980-)，男，碩士，副主任醫(yī)師。E-mail：shisen80@163.com