何成偉，鐘　勇，段保屹，廖春林，唐慧英，廖海燕，梁中平（.廣西憑祥出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣西憑祥5600；.廣西憑祥市水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局，廣西憑祥5600；.廣西憑祥市科技局，廣西憑祥5600）

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黃喉擬水龜致病菌-維氏氣單胞菌的鑒定及藥敏試驗(yàn)

何成偉1，鐘勇1，段保屹1，廖春林1，唐慧英2，廖海燕3，梁中平1
（1.廣西憑祥出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣西憑祥532600；2.廣西憑祥市水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局，廣西憑祥532600；3.廣西憑祥市科技局，廣西憑祥532600）

摘要：對(duì)患病黃喉擬水龜（Mauremys mutica）進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查和分離，對(duì)分離到1株革蘭陰性細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)特征、理化特征、VITEK 2 ZOMPACT 30自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定、結(jié)合16S rDNA序列的分子鑒定，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；進(jìn)行人工感染試驗(yàn)及藥物敏感性試驗(yàn)。結(jié)果分離到1株優(yōu)勢(shì)菌，根據(jù)此株分離菌的形態(tài)特征、理化特征、自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定、結(jié)合16S rDNA序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果，判定其為氣單胞菌屬的維氏氣單胞菌。此菌對(duì)供試健康黃喉擬水龜和小鼠有較強(qiáng)的致病作用，對(duì)供試20種抗菌藥物中的頭孢吡肟、阿米卡星、氧氟沙星、米諾環(huán)素高度敏感；對(duì)洛美沙星、恩諾沙星、氯霉素等3種中度敏感；對(duì)頭孢噻吩、環(huán)丙沙星等13種表現(xiàn)耐藥。表明所檢出的維氏氣單胞菌，是導(dǎo)致黃喉擬水龜以出血和腹水為主要病理特征的致病菌。

關(guān)鍵詞：維氏氣單胞菌；鑒定；藥敏；黃喉擬水龜

黃喉擬水龜（Mauremys mutica）為龜科擬水龜屬的爬行動(dòng)物。由于黃喉擬水龜具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，近年來(lái)人工集約化養(yǎng)殖蓬勃發(fā)展，隨之而來(lái)的疾病也越來(lái)越嚴(yán)重，這給養(yǎng)殖者帶來(lái)比較大的經(jīng)濟(jì)損失。2014年8月，廣西憑祥市某養(yǎng)殖戶8年龜發(fā)病，以急性腹瀉為特征性癥狀，患病動(dòng)物以出血和腹水為主要病理特征，發(fā)病率30%，死亡率20%，對(duì)病死龜進(jìn)行病理剖檢和病原分離，對(duì)分離到的菌株采用細(xì)菌表型特征、生化試驗(yàn)以及VITEK 2 ZOMPACT 30自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)分離菌株進(jìn)行了鑒定，并進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，證明黃喉擬水龜所患疾病是由維氏氣單胞菌引起。

1　材料與方法

1.1材料患病龜來(lái)源于廣西憑祥市某養(yǎng)殖戶。健康黃喉擬水龜6只，購(gòu)自另一養(yǎng)殖戶，每只體重約20 g。健康小鼠18只，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，每只體重20 g。

血液瓊脂平板，購(gòu)自鄭州安圖綠科生物工程有限公司；藥敏試紙、細(xì)菌生化微量鑒定管，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；VITEK 2 ZOMPACT 30自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)為法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品；營(yíng)養(yǎng)肉湯、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。PCR擴(kuò)增和測(cè)序試劑為生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌分離培養(yǎng)與純化洗凈病龜?shù)耐鈿?，體表用75%乙醇消毒后，無(wú)菌操作采集黃喉擬水龜?shù)母巍⒛I、心血于血平板和麥康凱培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)18～24 h，選取形態(tài)均一的優(yōu)勢(shì)菌群，挑取單菌落反復(fù)劃線純化3次，純化所得菌株4℃保存。

1.2.2細(xì)菌生物學(xué)鑒定

1.2.2.1形態(tài)觀察將保存菌株劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.2.2.2生化鑒定分離菌理化特性鑒定參照《水生微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)法》和《一般細(xì)菌常用鑒定方法》、《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》鑒定到種。

1.2.2.3分離菌用VITEK 2 ZOMPACT 30自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定取純化培養(yǎng)的單菌落接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)18～24 h，然后收集細(xì)菌。制備菌懸液，用0.45%NaCl溶液，制成0.5～0.63麥?zhǔn)蠁挝?，pH值5.5～7.2的菌懸液。選取革蘭陰性桿菌鑒定卡。28℃培養(yǎng)24 h，儀器自動(dòng)分析并給予鑒定結(jié)果。

1.2.2.4分子生物學(xué)鑒定取1 mL培養(yǎng)好的菌液，按照革蘭陰性菌提取試劑盒提取總DNA。使用25 μL反應(yīng)體系，使用DreamTaq Green PCR Master Mix （2×）（Thermo Scientific）試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增：DreamTaq Green PCR Master Mix（2×）12.5 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板2 μL，加水定容至25 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸9O s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后將陽(yáng)性樣品送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。所得序列采用Blastn程序進(jìn)行同源性檢索，采用ClustalX軟件進(jìn)行多序列全局比對(duì)，利用MEGA6.O軟件，選用Neighbour—Joining方法，自舉1000次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3動(dòng)物感染試驗(yàn)取純化的菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，28℃培養(yǎng)18 h。取1 mL作倍比稀釋用傾注平板法測(cè)定每毫升中的細(xì)菌數(shù)，其余于4℃下保存。次日用無(wú)菌生理鹽水將上述菌液稀釋成4.0×10 CFU/ mL的細(xì)菌懸液，用于動(dòng)物感染試驗(yàn)。

將6只健康黃喉擬水龜飼養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為2組：試驗(yàn)組4只，對(duì)照組2只。試驗(yàn)組，后腿肌肉注射0.3 mL菌液。對(duì)照組，后腿肌肉注射無(wú)菌生理鹽水0.5 mL。均置于水溫28℃、pH值7.2環(huán)境下飼養(yǎng)，從死亡龜中分離致病菌，并鑒定。

小鼠隨機(jī)分成3組，每組6只。第1組小鼠肌肉注射菌液0.1 mL/只，第2組小鼠肌肉注射菌液0.2 mL/只，第3組做對(duì)照組，注射無(wú)菌生理鹽水0.5 mL，28℃隔離飼養(yǎng)觀察，并及時(shí)記錄小鼠的發(fā)病和死亡情況，對(duì)死亡小鼠進(jìn)行細(xì)菌分離和鑒定。

1.2.4藥物敏感性試驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)Kirby -Bauer紙片擴(kuò)散法對(duì)分離菌株進(jìn)行常用的頭孢吡肟、環(huán)丙沙星等20種抗生素藥物的敏感性檢測(cè)，28℃培養(yǎng)24 h后，測(cè)定抑制圈直徑大小。

2　結(jié)果

2.1分離菌培養(yǎng)結(jié)果從患病黃擬水龜中分離純化培養(yǎng)得到形態(tài)均一的細(xì)菌。該菌在麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落表面光滑濕潤(rùn)、圓形、隆起、邊緣整齊、乳白色。營(yíng)養(yǎng)瓊脂上有灰白色、半透明濕潤(rùn)菌落生長(zhǎng)。在血平板上，可觀察到圓形、中央稍隆起、灰白色、明顯β溶血的菌落。革蘭染色鏡檢，該菌為革蘭陰性桿菌，菌體呈兩端鈍圓，多單個(gè)或成雙。

2.2生化鑒定結(jié)果菌株具有動(dòng)力性；不發(fā)酵木糖、肌醇、衛(wèi)矛醇、鼠李糖等；利用葡萄糖、棉子糖等；賴(lài)氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、氧化酶陽(yáng)性；精氨酸雙水解酶；其他生化結(jié)果見(jiàn)表1，參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和布坎南等編的《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，分離菌株的主要生化特征與維氏氣單胞菌特性基本一致，初步鑒定分離菌株為維氏氣單胞菌（A.veronii）。

表1　菌株生化特征

2.3VITEK 2 ZOMPACT 30自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果經(jīng)用VITEK 2 ZOMPACT 30自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定，分離菌為維氏氣單胞菌（A.veronii）。

2.4分子生物學(xué)鑒定結(jié)果以菌株的DNA為模板，擴(kuò)增引物：正向引物16Sf：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCA-3′，反向引物16Sr：5′-aaggaggtgatccagaa-3′，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳顯示擴(kuò)增出大小約1 500 bp的特異性條帶，結(jié)果見(jiàn)圖1。經(jīng)由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，得到實(shí)為1450bp大小的PCR產(chǎn)物片段，將序列進(jìn)行Blastn比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，16S rRNA分別與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的維氏氣單胞茵（A.veronii）不同菌株16S rRNA基因序列同源性高達(dá)99%。選取25個(gè)氣單胞菌屬細(xì)菌16S rRNA序列，以及5個(gè)弧菌屬（Vibrio）細(xì)菌16S rRNA序列作為外群，運(yùn)用ClustalX2.0，MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。分離菌株與A.veronii菌株HSCC（GenBank登錄號(hào)：KJ749842.1）聚為一簇。

2.5動(dòng)物感染試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過(guò)人工回歸感染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分離菌株對(duì)黃喉擬水龜具有高致病性，接種后，癥狀與自然發(fā)病癥狀基本一致，對(duì)照組未見(jiàn)任何異樣。從死亡龜和小鼠體內(nèi)分離到與接種完全相同的細(xì)菌。

2.6藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果分離菌對(duì)頭孢吡肟、阿米卡星、氧氟沙星、米諾環(huán)素敏感；對(duì)洛美沙星、恩諾沙星、氯霉素中度敏感；對(duì)頭孢噻吩、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、克林霉素、四環(huán)素、紅霉素、青霉素、復(fù)方新諾明、桿菌肽、阿莫西林表現(xiàn)耐藥。

圖1　菌株l6S rRNA基因擴(kuò)增結(jié)果：M：Marker；泳道1：菌株擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道2：陰性對(duì)照（以水為模板）

圖2　分離菌株與氣單胞菌屬細(xì)菌16S rRNA所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)||內(nèi)為Genbank序列登錄號(hào)

3　討論

本試驗(yàn)從發(fā)病黃喉擬水龜體內(nèi)分離的菌株對(duì)健康黃喉擬水龜表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病力，且回歸感染發(fā)病癥狀與自然發(fā)病龜?shù)陌Y狀相似，對(duì)照組不發(fā)病，證實(shí)分離菌株為該病的病原菌。根據(jù)生理生化鑒定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該菌與維氏氣單胞菌的生化標(biāo)準(zhǔn)基本一致，應(yīng)用VITEK 2 ZOMPACT 30自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定，系統(tǒng)鑒定此菌為維氏氣單胞菌，進(jìn)一步采用16 S rRNA基因進(jìn)行鑒定，16S rRNA分別與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的維氏氣單胞茵（A.veronii）不同菌株16S rRNA基因序列同源性高達(dá)99%，且系統(tǒng)分析顯示，分離菌株與維氏氣單胞菌在進(jìn)化樹(shù)上聚為一簇，結(jié)合病原菌的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)一步鑒定該菌為維氏氣單胞菌。

維氏氣單胞菌廣泛存在于水體、污泥、土壤中，可產(chǎn)生一系列的毒力因子，如氣溶素、腸毒素和粘附因子等[5]，這些毒力因子在水產(chǎn)動(dòng)物、人類(lèi)甚至畜禽感染中起著舉足輕重的作用，可引起斑點(diǎn)叉尾鮰、大鯢、錦鯉、鯰魚(yú)、中華絨螯蟹等大量死亡[2-4]。此外，該菌能感染人類(lèi)，引起急性腹瀉、菌血癥、腦膜炎和心內(nèi)膜炎等病癥，是一種致病性強(qiáng)的新型人-魚(yú)共患致病菌[5]，并在食品安全上表現(xiàn)出重要意義。本研究從患病的黃喉擬水龜分離到一株維氏氣單胞菌，經(jīng)人工回歸試驗(yàn)顯示出較強(qiáng)的致病性，進(jìn)一步揭示了該菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中的病原性意義。使用藥物防治此病，既要考慮細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性，也要遵守水產(chǎn)用藥規(guī)定。

參考文獻(xiàn)：

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作者簡(jiǎn)介：何成偉（1969-），男，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士，從事動(dòng)物疫病檢疫工作，E-mail：hcw321@sina.com

收稿日期：2014-12-17

中圖分類(lèi)號(hào)：S947.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：0529- 6005（2016）01- 0106- 03