林　雅，簡燕娟，方志超，范才良，程方?。?西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系，重慶榮昌40460；.重慶市大足區(qū)寶興鎮(zhèn)人民政府，重慶大足407；.重慶市榮昌縣畜牧獸醫(yī)局，重慶榮昌40460）

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48株大腸桿菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因型檢測

林雅1，簡燕娟2，方志超1，范才良3，程方俊1
（1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系，重慶榮昌402460；2.重慶市大足區(qū)寶興鎮(zhèn)人民政府，重慶大足402373；3.重慶市榮昌縣畜牧獸醫(yī)局，重慶榮昌402460）

摘要：為了解重慶地區(qū)部分鴨場大腸桿菌中超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）基因分布情況及抗生素的應(yīng)用對鴨場環(huán)境菌的影響。本試驗采用PCR技術(shù)，對48株大腸桿菌（包括20株病料分離株和28株鴨場土壤分離株）的ESBLs基因TEM、SHV、CTX-M進行檢測。結(jié)果表明，TEM、SHV、CTX-M型基因在病料分離株中的檢出率分別為100%、30%、25%，鴨場土壤中的檢出率分別為57.1%、21.4%、28.6%。不同來源的菌株均能檢測出耐藥基因，且部分細(xì)菌攜帶兩種以上耐藥基因；病料分離株和鴨場土壤分離株中攜帶的ESBLs基因均以TEM型為主。

關(guān)鍵詞：鴨源大腸桿菌；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶；耐藥基因

鴨大腸桿菌病是獸醫(yī)上常見的重要細(xì)菌病之一。隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，大腸桿菌的耐藥性日趨嚴(yán)重，給獸醫(yī)的臨床治療帶來了極大困難。產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是大腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要原因，其中，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）具有重要的臨床意義[1]。ESBLs是能同時耐青霉素、1-3代頭孢菌素及氨曲南的酶，該編碼基因家族有SHV、TEM、CTX-M等[2]。近年來，耐β-內(nèi)酰胺類抗生素的動物源大腸桿菌不斷被發(fā)現(xiàn)并引起全世界的關(guān)注。在國外，Aarestrup F. M.，N.Silva[3-4]等先后對攜帶產(chǎn)ESBLs的相關(guān)基因的大腸桿菌做了研究報道；在國內(nèi)，劉保光，田國寶等也先后作了相關(guān)報道[5-6]。

目前，耐藥基因型檢測是國內(nèi)外研究細(xì)菌對超光譜β-內(nèi)酰胺環(huán)類耐藥機制的重要領(lǐng)域之一。本試驗從重慶市渝西地區(qū)部分鴨場發(fā)病鴨采取病料及鴨場土壤采樣分離細(xì)菌，對分離菌株超光譜β-內(nèi)酰胺酶基因進行了檢測及分析。本試驗有助于了解重慶地區(qū)養(yǎng)鴨場內(nèi)大腸桿菌中ESBLs基因分布特點及抗生素的應(yīng)用對鴨場環(huán)境菌的影響，為重慶市鴨大腸桿菌病的防控及用藥提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗菌株于2013年3-9月在重慶地區(qū)多個養(yǎng)鴨場采集并分離純化、鑒定的大腸桿菌48株，包括從病料中分離致病菌20株，鴨場土壤中分離環(huán)境菌28株。

1.2試劑常規(guī)質(zhì)粒提取試劑盒E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I（購自廣州飛揚生物工程有限公司），PCR反應(yīng)試劑盒、Gold-view核酸染色劑、DL-2 000 Marker、6×Loading Buffer（購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）。

1.3PCR檢測ESBLs基因引物SHV、TEM、CTXM基因引物設(shè)計參照參考文獻(xiàn)[7]，TEM基因:上游：5′-GGGGATGAGTATTCAACATTTCC-3′，下游：5′-GGGCAGTTACCAATGCTTAATCA-3′；SHV基因:上游：5′- GGTTATGCGTTATATTCGCCTGTG-3′，下游：5′- TTAGCGTTGCCAGTGCTCGATCA-3′；CTX-M基因：上游：5′- GGGCTGAGATGGTGACAAAGAG-3′，下游：5′- CGTGCGAGTTCGATTTATTCAAC -3′。分別合成相應(yīng)PCR引物。模版DNA制備：按照試劑盒E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I操作步驟提取質(zhì)粒DNA。PCR反應(yīng)：PCR擴增采用25 μL體系。TEM基因反應(yīng)參數(shù)為：95℃5 min；95℃40 s，47℃40 s，72℃l min，循環(huán)30次；72℃10 min；SHV基因反應(yīng)參數(shù)為：95℃5 min；95℃1 min，52℃1 min，72℃1 min，循環(huán)30次；72℃10 min；CTX-M基因反應(yīng)參數(shù)為：95℃5 min；95℃45 s，55℃45 s，72℃45 s，循環(huán)30次；72℃10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠DNA成像儀分析結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1ESBLs基因PCR擴增結(jié)果

2.1.1ESBLs基因PCR擴增凝膠電泳結(jié)果ESBLs三種耐藥基因TEM、SHV、CTX-M的PCR擴增凝膠電泳結(jié)果，如圖1、圖2、圖3所示。圖示為部分耐藥基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖，大小與目的片段基因相符。1-20號為致病菌株，21-48號為環(huán)境菌株。

圖1　TEM基因凝膠電泳圖1、10、20：分別代表編號為1、10、20的致病菌株；29、34、44：分別代表編號為29、34、44的環(huán)境菌株；M：DL-2 000 DNA Marker

圖2　SHV基因凝膠電泳圖5、13、19：分別代表編號為5、13、19的致病菌株；26、34、44：分別代表編號為26、34、44的環(huán)境菌株；M：DL-2 000 DNA Marker

圖3　CTX- M基因凝膠電泳圖6：編號為6的致病菌株；22：編號為22的環(huán)境菌株；M：DL-2 000 DNA Marker

2.1.2ESBLs基因檢測結(jié)果分別統(tǒng)計致病菌株E. coli-1到E.coli-20和環(huán)境菌株E.coli-21到E.coli-48 ESBLs基因陽性數(shù)，結(jié)果見表1。從表中可知，48株大腸桿菌中TEM基因的檢出率為75%，SHV基因檢出率為25%。CTX-M基因檢測率為27.1%。TEM＋SHV復(fù)合基因檢出率22.9%；TEM＋CTX-M復(fù)合基因檢出率18.8%；SHV＋CTX-M復(fù)合基因檢出率8.3%；TEM＋SHV＋TEX-M復(fù)合基因檢出率4.2%。

表1　產(chǎn)ESBLs大腸桿菌菌株的耐藥基因檢測結(jié)果

3　討論

β-內(nèi)酰胺酶的出現(xiàn)對細(xì)菌性疾病的治療帶來了極大的威脅，特別是革蘭陰性桿菌中流行的ESBLs，成為獸醫(yī)臨床急待解決的難題。由于編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因多數(shù)為質(zhì)粒介導(dǎo)，使得耐藥基因可以在菌株之間通過結(jié)合和轉(zhuǎn)化等方式傳播，導(dǎo)致耐藥基因擴散蔓延[8]。對大腸桿菌中ESBLs基因的檢測，可了解ESBLs基因分布特點，為鴨場大腸桿菌病的防控及用藥提供參考依據(jù)。

在耐藥基因分布上，本試驗中產(chǎn)ESBLs的基因型檢測發(fā)現(xiàn)，從48株大腸桿菌耐藥基因檢測結(jié)果中TEM型、SHV型、CTX-M型均可見。TEM型陽性菌株較多見，這與許穎等[9]檢出的產(chǎn)ESBLs大腸桿菌主要基因型為TEM型相似，與李林等[10]關(guān)于CTX-M型檢出率高的結(jié)果稍有差異，另外，本試驗結(jié)果中SHV型檢出率占有一定比例，而苑麗[11]等對分離出30株雞源大腸桿菌產(chǎn)ESBLs的基因型檢測發(fā)現(xiàn)，SHV陽性率為0，可能是由于不同地區(qū)，不同宿主，不同的用藥情況等因素，導(dǎo)致耐藥基因型的分布率有所不同。有資料顯示，中國產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌基因型以CTX-M型為主，美國以TEM型和SHV型為主，歐洲從以TEM、SHV型轉(zhuǎn)變?yōu)橐訡TX-M型為主，也有資料稱近幾年來，世界各地頻繁地發(fā)現(xiàn)CTX-M型[12-13]，這些資料也進一步揭示不同地區(qū)流行的基因型的確有所差異。

從檢測結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)不同來源的菌株均能檢測出耐藥基因，且部分細(xì)菌攜帶兩種以上基因。說明質(zhì)粒介導(dǎo)及其他形式的耐藥基因傳遞，增加了SHV＋TEM、TEM＋CTX-M甚至TEM＋SHV＋TEX-M等基因型的出現(xiàn)，更增加了大腸埃希菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的復(fù)雜性與臨床用藥難度，應(yīng)引起臨床重視。

在研究結(jié)果中，病料分離株ESBLs耐藥基因的檢出率從高到低依次為TEM（100%）、SHV （30%）、CTX-M（25%）；鴨場環(huán)境分離株耐藥基因的檢出率從高到低依次為TEM（57.1%）、CTX-M （28.6%）、SHV（21.4%）。病料分離株與鴨場環(huán)境分離株耐藥基因的檢出率存在一定相關(guān)性，兩者攜帶ESBLs基因均以TEM型為主。但同一基因兩者的檢出率并不相同或相近，說明存在于病料分離株的大腸桿菌和環(huán)境分離株中的有一定差異?？赡苁怯捎讷F醫(yī)臨床上用藥不規(guī)范，且常常使用亞治療劑量的β-內(nèi)酰胺類抗生素作為飼料添加劑預(yù)防感染性疾病，從而導(dǎo)致鴨場環(huán)境中的大腸桿菌在藥物選擇的作用下，出現(xiàn)耐藥基因菌株。濫用抗生素，已對養(yǎng)殖場環(huán)境造成不良影響。環(huán)境中的耐藥菌可通過質(zhì)粒介導(dǎo)等方式，將耐藥基因傳遞給鴨體內(nèi)的大腸桿菌群，或者鴨群直接從環(huán)境中感染，再將易感染的大腸桿菌排泄入環(huán)境中，如此惡性循環(huán)，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失。

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Detection of extended- spectrum β- lactamases genotypeamong 48 Escherichiacoli

LIN Ya1，JIAN Yan-juan3，F(xiàn)ANG Zhi-chao1，F(xiàn)AN Cai-liang3，CHENG Fang-jun1
（1.Department of Veterinary Medicine，Rongchang Campus of Southwest University，Chongqing 402460，China；2.The People's Government of Baoxing town，Dazu district in Chongqing，Chongqing 402373，China；3.Animal Husbandry Bureau of Rongchang，Chongqing 402460，China）

Abstract：The purpose of this study was to detect genotype of ESBLs in E.coli isolated from duck and farm in Chongqing，and the influence of antibiotics on the environmental E.coli in farm.PCR amplifications was applied to detect the β-lactam resistant genotypes TEM，SHV，and CTX-M of extended-spectrum β-lactamases（ESBIs）from 48 isolates，20 isolated from duck and 28 isolated from farm.The results showed that the detection rates of drug resistant genotypes of TEM，SHV，and CTX-M from epidemic materials were 100%，30%，and 25%respectively，and those from soil were 57.1%，21.4%，and 28.6%，respectively.In conclusion，drug resistant genotypes or composite genotypes can be detected from strains of different sources，and the major ESBLs genotype was TEM.

Key words：Escherichia coli；ESBLs；Resistant gene

Corresponding author：CHENG Fang-jun

通訊作者：程方俊，E-mail：cfj-xn@163.com

作者簡介：林雅（1989-），女，碩士，研究方向為動物微生物學(xué)及免疫學(xué)，E-mail：lyaodly@163.com

基金項目：西南大學(xué)博士啟動基金2013BSr03

收稿日期：2014-05-28

中圖分類號：S852.61

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0100- 03