范美婧，陳媛，蔡興航，臧小丹，岳崇慧，孫琦，于廣吉，于國萍

(1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，哈爾濱150030；2.陜西中醫(yī)藥大學陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西咸陽712046）

不同處理方式對乳中β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性的影響

范美婧1，陳媛1，蔡興航2，臧小丹1，岳崇慧1，孫琦1，于廣吉1，于國萍1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，哈爾濱150030；2.陜西中醫(yī)藥大學陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西咸陽712046）

利用青霉素酶活性檢測試劑盒對乳中β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性進行檢測，分別對乳中β-內(nèi)酰胺酶的保存時間、滅菌方法和酸堿處理對其穩(wěn)定性影響進行了研究，從而對乳中β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性進行全面的評估。結(jié)果表明，青霉素酶活性檢測試劑盒檢測乳中的β-內(nèi)酰胺酶的最低檢測限為2 U/m L。樣品儲存時間越長β-內(nèi)酰胺酶的活性越小，并且減小程度與溫度正相關(guān)。常規(guī)滅菌方法均不能使β-內(nèi)酰胺酶徹底失活，酸堿處理對β-內(nèi)酰胺酶有不同程度的抑制，其中堿性條件下比酸性條件下抑制作用強。

快速檢測；β-內(nèi)酰胺酶；乳；穩(wěn)定性

0 引言

隨著物質(zhì)生活的極大提高，牛奶的質(zhì)量安全受到人們的關(guān)注，有不法生產(chǎn)者在牛奶中加入生物解抗劑，為了掩蓋抗生素的殘留，這種解抗劑就是從微生物中提取的β-內(nèi)酰胺酶[1-4]，它能對青霉素產(chǎn)生破壞或抑制作用。，這可使消費者對抗生素類藥物耐藥性增高，抵抗傳染病的能力降低，給消費者的身體健康帶來危害[5-7]。

現(xiàn)已有許多針對于β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法[8-10]。而少有針對β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性的相關(guān)研究，本文采用快速檢測試劑盒[11]對其穩(wěn)定性進行測定，根據(jù)市售牛奶制品的加工工藝及貯存方式，本實驗選取保存時間、滅菌方法和酸堿處理[12-14]三個條件進行研究，根據(jù)結(jié)果對β-內(nèi)酰胺酶的潛在危害性進行風險評估，為我國乳品行業(yè)衛(wèi)生質(zhì)量管理提供安全保障和理論支持。

1 實驗

1.1材料與設備

β-內(nèi)酰胺酶標準品(P0389-1 KU)，青霉素G標準品（25 g），青霉素酶活性檢測試劑盒，pH計。

1.2方法

1.2.1 檢測方法

北京優(yōu)尼賽斯科技有限公司提供的青霉素酶活性檢測試劑盒，具體操作步驟：將孵育器溫度調(diào)節(jié)至40℃，取5個玻璃試劑瓶，用移液器吸取400μL樣品加入到玻璃試劑瓶中，將加入樣品的玻璃試劑瓶放置于孵育器上溫育45 min。待溫育結(jié)束后，從玻璃試劑瓶中吸取200μL待檢樣品置于微孔中，反復抽吸幾次，使混合液均勻變成粉色。將微孔放入孵育器中溫育3 min，溫育結(jié)束后，將試劑條插入微孔中，繼續(xù)溫育3 min，溫育結(jié)束后，取出試劑條，觀察結(jié)果。判定方式如表1所示。

表1 判讀標準

1.2.2 最低檢測限的確定

將β-內(nèi)酰胺酶標準品加入到牛奶樣品中，配制含量分別為0.5，1，1.5，2，2.5，3，4 U/mL的樣品，然后用青霉素酶活性檢測試劑盒分別對其檢測，確定試劑盒最低檢測限。

1.2.3 貯存溫度和時間對牛奶中β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性的影響

步驟同1.2.1，配制β-內(nèi)酰胺酶終濃度分別達到2，2.5，3和4 U/mL。然后將其分別置于-18～-20，4，25和37℃無菌條件下貯藏1周，期間每1天用青霉素酶活性檢測試劑盒進行檢測。

1.2.4 滅菌方法對牛奶中β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性的影響

步驟同1.2.1，配置濃度為2，4，6，8，10，20，30，40 U/mL的β-內(nèi)酰胺酶標準品的牛奶樣品，分裝到10 mL的試管中，如表2所示的滅菌方法[15]進行處理，再通過青霉素酶活性檢測試劑盒進行檢測。

表2 滅菌方法對牛奶中β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性的影響

1.2.5 酸堿處理對牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的影響

步驟同1.2.1，配制濃度為2，3，4，5，6 U/mL的β-內(nèi)酰胺酶標準品的牛奶樣品，分別裝到10 mL的離心管中，用濃度為1 mol/L的鹽酸和1 mol/L的氫氧化鈉溶液分別將其pH值調(diào)制至3，4，5，6，7和8。再通過青霉素酶活性檢測試劑盒進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1青霉素酶活性檢測試劑盒最低檢測限的確定

用青霉素酶活性檢測試劑盒分別對樣品檢測，結(jié)果如表3所示，當溶液濃度≥2 U/mL時，能檢測出有β-內(nèi)酰胺酶。所以，青霉素酶活性檢測試劑盒的最低檢測限為2 U/mL。

表3 β-內(nèi)酰胺酶檢測限的測定

2.2貯存溫度和時間對牛奶中β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性的影響

用青霉素活性檢測試劑條檢測奶樣，檢測周期為1天1次，檢測結(jié)果如表4所示。

表4 不同溫度下貯存不同時間后β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性

由表4可以看出，在-18～-20℃和4℃下貯存1周，各個濃度的牛奶樣品都能檢出β-內(nèi)酰胺酶，貯存2周，仍能檢出（表內(nèi)未列出），說明低溫貯存條件對牛奶樣品中β-內(nèi)酰胺酶的活性基本沒有影響。在25℃下貯存1周，濃度為2.5，3，4 U/mL的牛奶樣品1周內(nèi)均能檢出β-內(nèi)酰胺酶；濃度為2 U/mL的樣品，貯存6 d已無法檢出。在37℃下貯存1周，濃度為3 U/mL和4 U/mL的樣品，一周內(nèi)均能檢出β-內(nèi)酰胺酶；濃度為2.5 U/mL的樣品，貯存第6天時已無法檢出；濃度為2 U/mL的樣品，貯存第3天時已無法檢出。

比較25℃和37℃條件下的牛奶樣品，濃度為3 U/mL和4 U/mL的牛奶樣品基本沒有變化，分析低濃度2 U/mL的樣品，37℃條件下的樣品第3天開始就無法檢出，25℃從第6天開始無法檢出。隨著貯存時間的增長，牛奶樣品中β-內(nèi)酰胺酶的活性呈下降趨勢。同時說明隨著貯存溫度的升高，加速了β-內(nèi)酰胺酶的活性減少，但沒有完全失活。

2.3滅菌方法對牛奶中β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性的影響

用青霉素活性檢測試劑條檢測不同滅菌方法的牛奶樣品，結(jié)果如表5所示。

表5 63，75，100和121℃下β-內(nèi)酰胺酶酶活的變化

由表5可以看出，在63℃和75℃加熱30 min和1 h時，當含β-內(nèi)酰胺酶標準品的牛奶樣品濃度為2，4，6，8 U/mL時，均未檢測出β-內(nèi)酰胺酶。當牛奶樣品濃度為10 U/mL和20 U/mL時，均檢測出β-內(nèi)酰胺酶，這說明巴氏滅菌（63℃和75℃）方法對低濃度的β-內(nèi)酰胺酶有一定的滅活作用，而對于高濃度的β-內(nèi)酰胺酶即大于10 U/mL時，巴氏滅菌方法對β-內(nèi)酰胺酶的滅活作用不明顯。

在100℃加熱不同時間時，當牛奶樣品含β-內(nèi)酰胺酶的濃度為2，4，6，8 U/mL時，均未檢測出β-內(nèi)酰胺酶。當牛奶樣品濃度大于10 U/mL時，加熱處理時間小于30 min后，均檢測出β-內(nèi)酰胺酶，但是從試劑條中可以發(fā)現(xiàn)當β-內(nèi)酰胺酶濃度為10 U/mL時，第二個指示橫杠顏色隨著加熱時間延長明顯變淺，說明β-內(nèi)酰胺酶的活性在較高溫度隨著時間的增加而有所降低。

而對于121℃條件，當濃度為10 U/mL和20 U/mL時，牛奶樣品在121℃下加熱處理15 s，1 min，10 min后，β-內(nèi)酰胺酶被檢測出，而加熱30 min后，β-內(nèi)酰胺酶未被檢測出。將濃度增至30 U/mL和40 U/mL，在121℃下加熱處理30 min后，β-內(nèi)酰胺酶被檢測出（結(jié)果未列出）。說明在超高溫度下處理牛奶樣品對β-內(nèi)酰胺酶的活性影響較大。

2.4酸堿處理對牛奶中β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性的影響

用青霉素活性檢測試劑盒檢測對酸堿處理的含β-內(nèi)酰胺酶標準品的牛奶樣品，結(jié)果如表6所示。

表6 在不同pH值下β-內(nèi)酰胺酶酶活的變化

由表6可以看出，當pH值為6和7時，所有濃度的含β-內(nèi)酰胺酶標準品的牛奶樣品均被檢出，且被檢出的最低濃度與試劑盒最低檢測限相同，均為2 U/mL。當pH值為5時，青霉素酶活性檢測試劑盒在β-內(nèi)酰胺酶濃度為3 U/mL時才檢出，牛奶樣品中的β-內(nèi)酰胺酶最低檢測限升高，可能是酸性條件下導致β-內(nèi)酰胺酶活力降低。當pH值為3和4時，青霉素酶活性檢測試劑盒在β-內(nèi)酰胺酶的濃度為4 U/mL時才檢出，牛奶樣品中的β-內(nèi)酰胺酶最低檢測限進一步升高，但β-內(nèi)酰胺酶仍具有一定的活性。說明隨著pH值的降低，β-內(nèi)酰胺酶的活性有所減弱。當pH值為8時，青霉素酶活性檢測試劑盒在β-內(nèi)酰胺酶的濃度為5 U/mL時才檢出，牛奶樣品中的β-內(nèi)酰胺酶活性大幅度降低，且下降速率比酸性條件快，說明酸或堿性條件均對β-內(nèi)酰胺酶有破壞作用。

3 結(jié)論

本研究通過快速檢測試劑盒對β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性進行測定，分別對β-內(nèi)酰胺酶的保存時間、滅菌方法和酸堿處理進行研究。

（1）隨著貯存時間的增加，β-內(nèi)酰胺酶的活性減小，并且減小程度與溫度成正相關(guān)。但是活性沒有完全喪失，表明β-內(nèi)酰胺酶在乳中有很高的穩(wěn)定性。

（2）對于滅菌方法，巴氏滅菌及短時間煮沸對β-內(nèi)酰胺酶無明顯影響，長時間煮沸和高溫對β-內(nèi)酰胺酶有不同程度的滅活效果，表明β-內(nèi)酰胺酶有很強的耐熱性，一些滅菌方法都不能徹底的使β-內(nèi)酰胺酶失活。

（3）酸堿處理對乳中β-內(nèi)酰胺酶有不同程度的抑制作用，β-內(nèi)酰胺酶對酸具有較強的耐受性，堿的抑制作用比酸的強，說明β-內(nèi)酰胺酶在酸乳制品仍能表現(xiàn)出較高活性。

本研究的意義在于表明如果原料乳中含有β-內(nèi)酰胺酶，以此為原料制備的牛奶制品，在生產(chǎn)加工后仍會有殘留，尤其是低溫巴氏奶，這對消費者的健康是極大的威脅，所以我們應從源頭抓起，對原料乳的質(zhì)量安全進行監(jiān)控，從而減少β-內(nèi)酰胺酶對消費者的危害。

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Effect of different treatment on the stability ofβ-lactamase in milk

FAN Meijing1,CHEN Yuan1,CAIXinghang2,ZANG Xiaodan1,YUE Conghui1,SUN Qi1, YU Guangji1,YU Guoping1
(1.College of food science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030，China；2.Shanxi University of Chinese Medicine,Shannxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal,Xianyang 712046，China)

The stability ofβ-lactamase in milk was detected with Penicillin activity detection kit in this study,and the effect ofthe hold time, sterilization methods and acid or alkaline environment on stability ofβ-lactamase in milk were studied respectively.A comprehensive assess?ment of the stability ofβ-lactamase was conducted finally.As a result,the detection limit ofβ-lactamase in milk is 2 U/mL when used the method of penicillin activity detection kit.The activity ofβ-lactamase was reduce as the hold time increase,the correlation between the de?crease degree of activity ofβ-lactamase and temperature was positively.The conventional sterilization methods could not completely make β-lactamase inactivated.There were different degrees of inhibition forβ-lactamase under acid or alkaline environment,wherein the inhibi?tion of alkaline treatmentwere stronger than thatofacid.

rapid detection;β-lactamase;stability

Q93-33

A

1001-2230（2017）04-0008-03

2016-09-13

國家科技支撐計劃（2013BAD18B00）。

范美婧（1992-），女，碩士，從事食品質(zhì)量與安全方面的研究。

于國萍