楊軍國(guó)，王麗麗，陳鍵，宋振碩，陳林

乙醇在茶葉多糖提取中的應(yīng)用研究

楊軍國(guó)，王麗麗，陳鍵，宋振碩，陳林*

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建福安355015)

乙醇預(yù)處理茶葉后，再通過(guò)水提可實(shí)現(xiàn)高茶多糖提取物的制備。以安溪鐵觀音為原料，以茶多糖、茶多酚、可溶性蛋白含量和浸出物得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察乙醇預(yù)提取茶葉中乙醇濃度、料液比、溫度、提取時(shí)間等因素的影響。單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，正交試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，溫度為醇提茶葉的最顯著因素，乙醇濃度次之，而料液比和提取時(shí)間影響最小。乙醇預(yù)處理茶葉最優(yōu)工藝參數(shù)組合為A1B2C2D1，即乙醇濃度65%、料液比1:25、溫度55℃、提取時(shí)間20 min，該工藝實(shí)施后可再通過(guò)水提制得更高含量的茶多糖，為其進(jìn)一步應(yīng)用開(kāi)展及工業(yè)化制備提供重要的理論依據(jù)。

乙醇;茶多糖;提取

茶多糖(Tea Polysaccharides，TPs)系茶葉中具有生物活性的復(fù)合多糖的簡(jiǎn)稱(chēng)，因其在降血糖方面的突出功效日益受到關(guān)注［1－2］，眾多學(xué)者進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)給出了明確的證實(shí)［3－5］。茶已逐漸發(fā)展為世人的普及飲料，其降血糖功效必將受到更廣泛的關(guān)注。關(guān)于多糖提取分離的方法，主要有酸堿法、水提醇沉法，以及近年新引入的酶解、超聲波、超臨界萃取、膜分離、色譜分離等提取分離技術(shù)［6－8］。然而，茶多糖是一類(lèi)雜多糖復(fù)合物，構(gòu)象繁雜，現(xiàn)階段加工制備僅限于實(shí)驗(yàn)室階段，常采用纖維素陰離子交換柱層析法和凝膠柱層析法對(duì)其進(jìn)行分級(jí)和純化，限于成本和得率，尚難用于工業(yè)化生產(chǎn)［9－10］。因此，研究開(kāi)發(fā)高茶葉多糖產(chǎn)品的工業(yè)化提取制備，對(duì)其進(jìn)一步應(yīng)用開(kāi)展尤為重要。

乙醇可用于包括茶葉在內(nèi)多種植物多糖的分級(jí)純化，且安全環(huán)保，發(fā)展前景廣闊［11－13］。亦可用于蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、大分子色素等其他物質(zhì)液相條件下的沉淀析出，而對(duì)茶葉中多酚、氨基酸等小分子物質(zhì)則有助于水相的浸出。據(jù)蕭力爭(zhēng)等［14］研究報(bào)道，采用50%乙醇浸提后，茶葉各品質(zhì)成分的浸出率顯著高于常規(guī)水提，總浸出物、氨基酸、茶多酚及碳水化合物分別高出1.39、1.09、1.44和1.23倍。前期本課題組開(kāi)展了乙醇沉淀分級(jí)茶多糖特性研究，結(jié)果表明70%濃度乙醇沉淀分級(jí)效果最優(yōu)，且抗氧化活性強(qiáng)［15－16］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，采用不同提取方式制得茶葉提取物中多糖含量不盡相同［17］。相較于先水提+后醇沉，先醇提+后水提的提取方式可實(shí)現(xiàn)茶葉提取物中多糖含量極顯著提高，達(dá)15%以上。針對(duì)該粗茶多糖，正交試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，醇預(yù)提后再水提階段料液比可顯著影響茶多糖含量，乙醇濃度則顯著影響粗茶多糖產(chǎn)品得率。由此，乙醇預(yù)處理茶葉階段影響因素如乙醇濃度、時(shí)間、溫度、料液比等等尚需進(jìn)一步考察研究，以達(dá)到更高效的分離去除茶多酚、可溶性蛋白、茶色素等主要物質(zhì)，富集純化茶葉多糖的目的。本文以安溪鐵觀音為原料，考察乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、料液比等因素對(duì)乙醇預(yù)處理茶葉的影響，從而實(shí)現(xiàn)茶葉浸提液中低多糖析出，而茶多酚、蛋白質(zhì)等主要物質(zhì)高析出，這將有助于通過(guò)水提制得更高多糖含量的茶制品，以期為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化制備高多糖茶葉提取物提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

安溪鐵觀音購(gòu)自閩南安溪茶區(qū);福林酚購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;蒽酮購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其余均為色譜純或分析純?cè)噭6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析); BioSpec－nano超微量分光光度計(jì)(島津公司); DK－8D型電熱恒溫水浴槽(上海一恒);DHC－9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茶葉乙醇浸提液的制備及檢測(cè)以茶多糖、茶多酚、可溶性蛋白和浸出物含量為指標(biāo)，以乙醇濃度(0、15%、30%、45%、60%、75%、90%)、浸提溫度(25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)、浸提時(shí)間(20 min、30 min、40 min、50 min、60 min)為研究因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)和多因素正交試驗(yàn)。具體方法如下:稱(chēng)取安溪鐵觀音茶葉3.00 g于250 mL錐形瓶中，常溫時(shí)(25℃)，按照料液比1∶15和玻璃棒攪拌浸提30 min以不同濃度乙醇浸提茶葉，同樣參數(shù)提取2次，收集浸提液定容至500 mL，檢測(cè)浸提液中茶多糖、茶多酚、可溶性蛋白和浸出物含量，綜合評(píng)價(jià)選取最優(yōu)乙醇濃度進(jìn)行其他因素的考察;在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)以選取最優(yōu)的浸提溫度、料液比和浸提時(shí)間。

1.2.2 乙醇預(yù)處理參數(shù)優(yōu)化單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)L9(3)4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，研究乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取溫度(C)、提取時(shí)間(D)等參數(shù)對(duì)茶葉浸提液中茶多糖、茶多酚、可溶性蛋白和浸出物含量的影響，試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)L9(34)因素和水平Table 1Factors and levels of L9(34)orthogonal experiment

1.2.3 茶多糖含量的測(cè)定采用蒽酮－硫酸法，以無(wú)水葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。吸取蒽酮試劑8.0 mL于25 mL容量瓶中，分別滴入1.0 mL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液(0、25、50、100、150、200 μg ·mL－1)，邊滴邊搖勻，沸水加熱3 min，快速冷卻，于600 nm處比色測(cè)定，以吸光度值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖含量(μg·mL－1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并計(jì)算線(xiàn)性回歸方程。吸取蒽酮試劑8.0 mL于25 mL容量瓶中，分別滴加浸提液樣品1.0 mL，搖勻后沸水加熱3 min，快速冷卻，600 nm處比色測(cè)定，并根據(jù)葡萄糖線(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算樣品中多糖含量。

1.2.4 茶多酚含量的檢測(cè)茶多酚含量檢測(cè)采用GB/T 8313－2008福林酚法。

1.2.5 可溶性蛋白含量的檢測(cè)BioSpec－nano超微量分光光度計(jì)以Cy3標(biāo)記蛋白，可在波長(zhǎng)280 nm時(shí)測(cè)量蛋白質(zhì)的濃度。準(zhǔn)確移取浸提液樣品溶液4 μL于超微量分光光度計(jì)目標(biāo)位置，以光程0.7 mm、波長(zhǎng)280 nm處檢測(cè)可溶性蛋白質(zhì)含量。1.2.6浸出物含量的測(cè)定參照《GB/T 8305－2013茶水浸出物測(cè)定》，與1.2.1茶葉浸提液的制備同步進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)分析采用Origin 7.5和Spss 19.0軟件，數(shù)值表示為平均值±S.E.。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乙醇濃度預(yù)處理對(duì)乙醇浸提液中主要內(nèi)含成份的影響

乙醇預(yù)處理茶葉以后，進(jìn)一步通過(guò)水相浸提可實(shí)現(xiàn)茶葉多糖的富集。由此，如何達(dá)到乙醇預(yù)處理茶葉的最優(yōu)化，即乙醇浸提液中更高含量的茶多酚、可溶性蛋白、茶色素等主要物質(zhì)而低含量的茶葉多糖，從而提高后續(xù)在水相浸提中，水相浸提物中茶葉多糖的富集程度。如圖1所示，為不同乙醇濃度常溫提取茶葉時(shí)浸提液中的茶多糖、茶多酚、可溶性蛋白及浸出物的含量變化。結(jié)果表明，茶多糖含量變化與乙醇濃度呈負(fù)相關(guān)，與對(duì)照相比，至75%濃度乙醇時(shí)呈顯著降低;而茶多酚、可溶性蛋白等含量變化則呈先升高后降低的趨勢(shì)，至60%濃度乙醇時(shí)含量最高，浸出物含量變化表達(dá)了同樣的趨勢(shì)(圖1B)。分析認(rèn)為，水溶液介電常數(shù)較高時(shí)(乙醇濃度≤60%)，益于茶多酚、可溶性蛋白、茶葉浸出物等物質(zhì)的浸出，隨著水溶液介電常數(shù)的降低(乙醇濃度≥75%)開(kāi)始呈反作用效果，而茶葉中水溶性多糖與水溶液介電常數(shù)呈正相關(guān)，含量逐步降低。綜合來(lái)看，與低劑量乙醇相比，75%濃度乙醇提取茶葉時(shí)，浸提液中茶葉多糖含量顯著降低，浸出物含量變化并未呈差異顯著性，而90%濃度乙醇浸提茶葉時(shí)浸提液中所有物質(zhì)均呈顯著性降低，導(dǎo)致水相浸提茶葉多糖并未起到富集的效果。因此，選取75%濃度作為乙醇處理茶葉的最佳濃度，達(dá)到最佳的去除茶多酚和保留較多茶多糖的效果。

圖1 不同乙醇濃度下茶葉浸提液中主要物質(zhì)含量變化Fig.1Contents of major constituents in tea extracts with different ethanol concentrations for pretreatment

2.2 不同溫度對(duì)醇提茶葉的影響

圖2為不同提取溫度下75%濃度乙醇茶葉浸提液中主要物質(zhì)的含量變化，結(jié)果表明，茶多糖、茶多酚、可溶性蛋白及浸出物均呈溫度依賴(lài)效應(yīng)，隨著溫度的提高其含量逐漸增加(圖2)。如圖所示，按差異顯著性分析可劃分為低溫區(qū)間25～ 55℃和高溫區(qū)間65～85℃，溫度區(qū)間內(nèi)茶多糖、茶多酚及浸出物等含量變化未見(jiàn)差異顯著性;相較于常溫提取，至85℃時(shí)呈顯著性提高。比較來(lái)看，可溶性蛋白的含量變化受溫度影響較大，提取溫度45℃時(shí)已達(dá)顯著性提升。綜合分析，選取55℃作為乙醇預(yù)處理脫雜的最優(yōu)溫度。

圖2 不同溫度下醇提茶葉中主要物質(zhì)含量變化Fig.2Contents of major constituents in tea extracts with different pretreatment temperatures

2.3 不同料液比對(duì)醇提茶葉的影響

如圖3所示，為不同料液比下75%濃度乙醇55℃時(shí)茶葉浸提液中的主要物質(zhì)含量變化。結(jié)果表明，茶多糖與可溶性蛋白含量受料液比影響較小，未見(jiàn)差異顯著性變化;茶多酚含量與料液比呈正相關(guān)，至1∶20時(shí)顯著提高(圖3A)。從浸出物得率來(lái)看，趨勢(shì)與茶多酚變化相同，至1∶25時(shí)顯著提高(圖3B)。由此，選取料液比1∶25時(shí)作為最優(yōu)處理，浸出物及茶多酚析出量高。

2.4 不同提取時(shí)間對(duì)醇提茶葉的影響

圖4為不同提取時(shí)間下茶醇提液中主要物質(zhì)含量變化，結(jié)果表明，茶多糖及茶多酚含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，40 min時(shí)呈顯著性提升，多糖析出明顯增大;相較來(lái)看，可溶性蛋白含量變化未見(jiàn)差異顯著性(圖4A)。同時(shí)，茶葉浸出物得率亦呈遞增趨勢(shì)，50 min時(shí)明顯增大(圖4B)。鑒于本文試驗(yàn)要求醇提液中低含量的多糖析出，而茶多酚、可溶性蛋白、浸出物等高含量析出，綜合分析選取30 min進(jìn)行正交試驗(yàn)的處理參數(shù)優(yōu)化。

2.5 醇提茶葉參數(shù)優(yōu)化

單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定多因素協(xié)同作用對(duì)醇提處理茶葉的影響，從而進(jìn)一步獲得高多糖含量的茶制品。選擇L9(34)正交表，考察乙醇濃度、溫度、料液比、提取時(shí)間等因素對(duì)醇提處理茶葉的影響，以茶多糖、茶多酚、可溶性蛋白含量及浸出物得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，要求醇處理茶葉浸提液中茶多糖含量低而茶多酚、可溶性蛋白及浸出物含量高，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

圖3 不同料液比下醇提茶葉中主要物質(zhì)含量變化Fig.3Contents of major constituents in tea extracts with different ethanol/tea ratio in pretreatment

圖4 不同提取時(shí)間下醇提茶葉中主要物質(zhì)含量變化Fig.4Contents of major constituents in tea extracts with different pretreatment durations

由表3直觀分析可知，不同的評(píng)價(jià)指標(biāo)各因素主次順序基本相同，即茶多糖C＞A＞B＞D、茶多酚C＞A＞D＞B、可溶性蛋白C＞A＞B＞D和浸出物得率C＞A＞D＞B，可見(jiàn)影響醇處理茶葉浸提液中物質(zhì)含量的主要因素為溫度和乙醇濃度。本文以醇處理茶葉浸提液中茶多糖含量低為優(yōu)選擇，由此茶多糖因素優(yōu)組合為A3B3C1D1，與茶多酚、可溶性蛋白及浸出物得率的優(yōu)組合A1B1C3D3有所不同。為此，進(jìn)一步通過(guò)方差分析確定顯著因素與非顯著因素，綜合確立醇處理茶葉的最佳工藝參數(shù)組合。由表4可知，溫度是醇提液中茶多糖、茶多酚、可溶性蛋白及浸出物等物質(zhì)含量變化的首要影響因素，對(duì)可溶性蛋白及浸出物得率呈顯著影響，乙醇濃度次之，僅對(duì)浸出物得率有顯著性影響，料液比及提取時(shí)間影響較小，而各因素對(duì)茶多糖和茶多酚的含量變化未見(jiàn)顯著性影響。結(jié)合表3的直觀分析結(jié)果，溫度是首要的考慮因素，茶多糖優(yōu)水平C1，其他物質(zhì)優(yōu)水平為C3，綜合確立為優(yōu)水平C2。乙醇濃度對(duì)茶多糖含量變化影響小卻顯著影響浸出物得率，由此確立優(yōu)水平A1。而料液比和提取時(shí)間對(duì)醇提液中物質(zhì)的含量變化影響最小，可從成本方面予以考慮，確立為優(yōu)水平C2D1。由此，獲得醇處理茶葉的最優(yōu)水平組合為A1B2C2D1，即乙醇濃度65%、料液比1∶25、溫度55℃、提取時(shí)間20 min，從而可致乙醇茶葉浸提液中茶多糖析出量低，同時(shí)茶多酚、可溶性蛋白及浸出物析出量高，實(shí)現(xiàn)水相提取制備茶多糖時(shí)的高富集。

表2 正交試驗(yàn)L9(34)結(jié)果Table 2Results of L9(34)orthogonal experiment

表3 正交試驗(yàn)L9(34)極差直觀分析表Table 3Visual analysis on range of L9(34)orthogonal experiment

表4 正交試驗(yàn)L9(34)方差分析Table 4Variance analysis on L9(34)orthogonal experiment

3 結(jié)論與討論

乙醇可用于茶多糖的提取分離，多采用水提醇沉的方法［18－20］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，先采用一定濃度的乙醇提取茶葉后，茶葉再進(jìn)一步經(jīng)水相提取可達(dá)到富集茶多糖的目的，含量達(dá)15%以上，并且具有更高的抗氧化活性［17］。烏龍茶中含量高于綠茶和紅茶，約占干重的2.63%［21］，導(dǎo)致茶葉中茶多糖的單體提取分離制備運(yùn)行成本過(guò)高，尚難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，其綜合分離制備將具有廣闊的發(fā)展前景。因此，乙醇預(yù)提取茶葉可作為在茶多糖提取分離中應(yīng)用的新視點(diǎn)，同時(shí)兼具制備茶多酚和高茶多糖茶提取物，且易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。然而，以茶多糖為評(píng)價(jià)指標(biāo)，有關(guān)乙醇預(yù)提取茶葉尚未見(jiàn)報(bào)道。本文正交試驗(yàn)結(jié)果表明，溫度為醇提茶葉的最顯著因素，乙醇濃度次之，而料液比和提取時(shí)間影響最小，乙醇預(yù)處理最優(yōu)工藝參數(shù)組合為A1B2C2D1，即乙醇濃度65%、料液比1∶25、溫度55℃、提取時(shí)間20min。該工藝條件實(shí)施下，乙醇處理茶葉浸提液中低析出茶多糖而茶多酚、可溶性蛋白及浸出物高析出，從而進(jìn)一步水相提取茶葉后可獲得更高含量的粗茶多糖，這為其進(jìn)一步應(yīng)用及工業(yè)化生產(chǎn)提供重要的理論依據(jù)。

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Ethanol Pretreatment in Polysaccharide Extraction of Tea

YANG Jun-guo，WANG Li-li，CHEN Jian，SONG Zhen-shuo，CHEN Lin*
(Tea Research Institute，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)u’an，F(xiàn)ujian 355015，China)

After the pre-extraction of tea with ethanol，tea polysaccharides were enriched in the further water extracts.In this paper，Anxi Tieguanyin was employed to assess the effects of ethanol concentration，ratio of solid to liquid，temperature and time on the pre-ethanol extracting tea via the contents of tea polysaccharide，tea polyphenols，soluble proteins and extracts yield.Based on the single factor test，orthogonal test suggested that temperature was the most significantly factor，ethanol concentration the second，and the least of solid-liquid ratio and time.The optimal pre-extracting conditions with ethanol for the high content of tea polysaccharides in the further water extracts were A1B2C2D1as follows:25 time liquid of solid，extracted at 55℃for 20min with 65%ethanol，and provided the theoretical base for its application and industrial production.

ethanol;tea polysaccharides;extraction

Q 538

A

2096－0220(2016)04－0192－08

2016－10－21初稿;2016－11－29修改稿

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015J05057);福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院“青年科技英才百人計(jì)劃”項(xiàng)目(YC2015－8);福建省屬公益類(lèi)科研院所基本科研專(zhuān)項(xiàng)(2015R1012－8);福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所重點(diǎn)項(xiàng)目(2014－cys－03)。

楊軍國(guó)(1980－)，男，博士，主要從事茶葉生物化學(xué)與綜合利用。E－mail:95711139@qq.com

*通訊作者:陳林(1975－)，男，博士，副研究員，主要從事茶葉加工、茶葉生物化學(xué)與綜合利用。E－mail:82785676@qq.com