岳　虹，陳芙蓉，王夢(mèng)麗，謝紅英，馮亞男，徐小平

（四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川成都610041）

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HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定桔梗中5種皂苷含量

岳虹，陳芙蓉，王夢(mèng)麗，謝紅英，馮亞男，徐小平

（四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川成都610041）

摘要：建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定桔梗藥材中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的方法。色譜柱為ODS 250 mm×4.6 mm×5μm，流動(dòng)相A為乙腈-0.2%甲酸，流動(dòng)相B為水，采用梯度洗脫（0～15min，20%～22%A；15～60min，22%A；60～65min，22%～30%A；65～70min，30%～20%A）。供試品經(jīng)50%甲醇（ν/ν）超聲提取30min，過(guò)濾蒸干后以50%甲醇（ν/ν）定容至5mL容量瓶中；漂移管溫度為75℃，氮?dú)饬髁繛?.5L/min。去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D分別在0.64～6.4μg、1.22～12.2μg、1.08～10.8μg、0.74～7.4μg，1.7～17μg范圍內(nèi)組分濃度與峰面積線性關(guān)系良好；藥材中5種成分的平均加標(biāo)回收率分別為101.1%、99.9%、100.4%、100.7%和101.6%；RSD均＜5%。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，分離效果好，可用于桔梗藥材的質(zhì)量控制。關(guān)鍵詞：桔梗；桔梗皂苷；HPLC-ELSD；梯度洗脫

0　引言

桔梗（Platycodon radix（Jacq.）A.DC.）為桔?？疲–ampanulacae）桔梗屬（Platycodin）多年生草本植物[1]，廣泛分布于東亞地區(qū)，我國(guó)多地區(qū)均有種植。桔梗的主要活性成分是齊墩果烷型三萜皂苷，藥理研究表明桔梗皂苷具有多種活性，包括抗癌、抗氧化、抗丙肝、減肥等功能[2-3]，而對(duì)桔梗藥材質(zhì)量的有效控制是其發(fā)揮藥效的基礎(chǔ)。

我國(guó)幅員遼闊，桔梗藥材生長(zhǎng)環(huán)境差異大，導(dǎo)致其質(zhì)量良莠不齊，有效成分含量變化大，有必要加強(qiáng)其質(zhì)量控制以保證藥效[4-5]。桔梗中皂苷成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，活性多樣，而在《中國(guó)藥典》2010版中僅對(duì)桔梗皂苷D（Platycodin D，PD）設(shè)定了含量限度[6]，不能更全面地反映藥效和控制桔梗藥材質(zhì)量。本文通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地桔梗中去芹糖桔梗皂苷E（deapioplatycoside E）、桔梗皂苷E（platycoside E）、桔梗皂苷D3（platycodin D3）、去芹糖桔梗皂苷D（deapioplatycodin D）及桔梗皂苷D（platycodin D）5種桔梗皂苷成分進(jìn)行測(cè)定，建立了桔梗皂苷HPLC-ELSD含量測(cè)定方法，為桔梗藥材質(zhì)量控制提供參考。

1　儀器與試藥

1.1儀器

LC-100高效液相色譜儀（上海伍豐儀器公司）；ELSD-UM 5000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（上海通微分析技術(shù)有限公司）；N2000數(shù)據(jù)采集軟件（浙江大學(xué)）；MS105DU電子天平（瑞士梅特勒托利多儀器公司）；LEO-801超聲清洗器（昆山超聲設(shè)備有限公司）。

1.2試藥與樣品

桔梗藥材樣品分別購(gòu)自山東、安徽、甘肅、四川、及河北等桔梗產(chǎn)區(qū)（見(jiàn)表7），均為桔梗科植物桔梗（Platycodon radix（Jacq.）A.DC.）的根。桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷E、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3對(duì)照品均為實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)HPLC面積歸一化法測(cè)定純度高于98%；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱Promasil C18（250mm×4.6mm×5μm），柱溫30℃；流動(dòng)相A為乙腈-0.2%甲酸，流動(dòng)相B為水，梯度洗脫（0～15min，20%～22%A；15～60min，22%A；60～65min，22%～30%A；65～70min，30%～20%A）。流量1.0mL/min；進(jìn)樣量20 μL；ELSD檢測(cè)器檢測(cè)參數(shù)：漂移管溫度75℃，載氣（N2）流量2.5 L/min。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D適量，加50%甲醇制成每1mL分別含有去芹糖桔梗皂苷E 0.32mg、桔梗皂苷E 0.61mg、桔梗皂苷D30.54mg、去芹糖桔梗皂苷D 0.37mg、桔梗皂苷D 0.85 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3供試品溶液的制備

取桔梗樣品2.0g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入50%甲醇50mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30min，取出，常溫冷卻，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足損失質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液25mL，在60℃下減壓蒸干，殘?jiān)由倭?0%甲醇轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

圖1　桔梗藥材和5種皂苷對(duì)照品的HPLC-ELSD譜圖

2.4供試品溶液的制備方法優(yōu)化

2.4.1提取溶劑的考察

取桔梗藥材粉末（批號(hào)20130615，產(chǎn)地安徽亳州）（過(guò)5#號(hào)篩）3份，各2.0g，精密稱定，分別精密加入甲醇、50%甲醇和水50mL，每份稱3個(gè)平行樣，按照2.3供試品的制備方法進(jìn)行制備，測(cè)定供試品溶液中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的含量，結(jié)果顯示，50%甲醇提取的5種桔梗皂苷含量高于甲醇和水，因此選擇50%甲醇作為提取溶劑。

2.4.2提取方式的考察

取桔梗藥材粉末（批號(hào)20130615，產(chǎn)地安徽亳州）（過(guò)5#號(hào)篩）4份，各2.0 g，精密稱定，精密加入50%甲醇50mL，稱定質(zhì)量，分別超聲處理15min、30min、1h，回流提取2 h，按照2.3供試品的制備方法進(jìn)行制備，測(cè)定供試品溶液中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。由表可知，在超聲30min后，5種桔梗皂苷已基本提取完全，且超聲30min與回流2h效果相當(dāng)。為操作簡(jiǎn)便，采用超聲30min作為提取方式。

表1　不同提取方式對(duì)桔梗皂苷提取的影響

2.4.3料液比的考察

取桔梗藥材粉末（批號(hào)20130615，產(chǎn)地安徽亳州）（過(guò)5#號(hào)篩）4份，各2.0 g，精密稱定，分別加入50%甲醇30，40，50，60mL，稱定質(zhì)量，超聲30min后，按照2.3供試品的制備方法進(jìn)行制備，測(cè)定供試品溶液中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的含量，如表2所示。結(jié)果表明在其他提取條件一致的情況下，料液比為1：25時(shí)桔梗皂苷提取較為徹底，因此選擇提取料液比為1：25。

表2　不同提取料液比的考察

2.4.4提取次數(shù)的考察

取桔梗藥材粉末（批號(hào)20130615，產(chǎn)地安徽亳州）（過(guò)5#號(hào)篩）3份，各2.0 g，精密稱定，分別加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，對(duì)3份供試品分別提取1，2，3次，分別合并2次和3次提取液，按照供試品的制備方法測(cè)定供試品溶液中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的含量，結(jié)果顯示在其他提取條件一致的情況下，提取1次已經(jīng)基本將供試品中5種皂苷成分提取出，因此選擇提取次數(shù)為1次。

2.5線性范圍考察

精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液2，4，8，12，16，20μL，分別注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，以峰面積的自然對(duì)數(shù)（y）對(duì)進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表3，表明各成分在相應(yīng)范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表3　桔梗皂苷的線性關(guān)系考察

2.6進(jìn)樣精密度

精密吸取混合對(duì)照品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定各成分峰面積的自然對(duì)數(shù)值并計(jì)算RSD。去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的RSD值分別為1.2%，2.3%，2.8%，3.4%，0.9%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一對(duì)照品溶液，分別于0，4，10，24，28，30h注入液相色譜儀，測(cè)定各成分峰面積的自然對(duì)數(shù)值并計(jì)算RSD值。去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的RSD值分別為1.8%，1.3%，2.1%，1.4%，1.9%，結(jié)果表明對(duì)照品溶液在30h穩(wěn)定性良好。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次桔梗藥材（批號(hào)20130615，產(chǎn)地安徽亳州），平行制備6份供試品溶液，按照2.3供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析。根據(jù)所測(cè)峰面積的自然對(duì)數(shù)計(jì)算各成分在樣品中的含量。結(jié)果表明去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的平均含量分別為0.06%，0.23%，0.21%，0.08%，0.31%，RSD分別為1.2%，2.2%，1.6%，1.0%，1.8%，該方法重復(fù)性較好。

2.9加標(biāo)回收率試驗(yàn)

表4　桔梗皂苷平均加標(biāo)回收試驗(yàn)（n=6）

取已知含量的桔梗藥材粉末適量，精密稱定，置具塞三角瓶中，分別精密加入去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D對(duì)照品適量，按照2.3供試品制備方法操作，制備6份加標(biāo)供試品溶液。吸取加標(biāo)供試品溶液20μL注入液相色譜儀，測(cè)定各成分平均含量。根據(jù)測(cè)得量和加入量，計(jì)算各待測(cè)成分的回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.10樣品測(cè)定

取不同產(chǎn)地的桔梗藥材，按照2.3供試品制備方法制備供試品溶液，測(cè)定樣品中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D的含量，平行測(cè)定3次，結(jié)果如表5所示。

表5　不同產(chǎn)地桔梗藥材的測(cè)定結(jié)果（n=3）%

3　討論

桔梗的主要成分是三萜皂苷，這一類(lèi)型化合物結(jié)構(gòu)缺乏強(qiáng)紫外吸收的生色團(tuán)，僅在苷元C12-C13位置上具有單一雙鍵，使其在210nm附近具有紫外吸收，該波長(zhǎng)范圍為溶劑末端吸收區(qū)，易產(chǎn)生溶劑干擾和基線的不穩(wěn)定，從而對(duì)樣品的測(cè)定產(chǎn)生干擾，造成測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。而采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器則因成分對(duì)激光光源發(fā)生散射產(chǎn)生信號(hào)進(jìn)行測(cè)定，避免了紫外吸收干擾，從而適用于皂苷類(lèi)弱紫外吸收成分的測(cè)定[7-9]。

在《中國(guó)藥典》2010年版中有關(guān)桔梗含量測(cè)定項(xiàng)下采用的色譜條件是25%乙腈等度洗脫，但在色譜條件下需要對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理才能取得較為理想的分離度。為此，本試驗(yàn)采用梯度洗脫的方式可更有效地同時(shí)分離混合樣品中的各個(gè)組份，同時(shí)簡(jiǎn)化了樣品前處理步驟，縮短了分析時(shí)間，提高工作效率。

通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地10批次的桔梗藥材進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明去芹糖桔梗皂苷D和桔梗皂苷D是桔梗藥材中的主要皂苷成分，且這兩種成分在不同產(chǎn)地的桔梗藥材中的含量都較為穩(wěn)定。另外，有研究表明去芹糖桔梗皂苷D具有多種藥理活性[10-12]。因此，除藥典原有的桔梗皂苷D以外，提示去芹糖桔梗皂苷D可成為桔梗藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的待選指標(biāo)，以便提高藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

4　結(jié)束語(yǔ)

本方法操作簡(jiǎn)便，定量準(zhǔn)確，實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)定桔梗藥材中5種桔梗皂苷的含量，可應(yīng)用于桔梗藥材的質(zhì)量控制。

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（編輯：徐柳）

Simultaneous determination of the content of 5 Platycosides in Platycodon radix

YUE Hong，CHEN Furong，WANG Mengli，XIE Hongying，F(xiàn)ENG Ya’nan，XU Xiaoping
（West China School of Pharmacy，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

Abstract:Simultaneously determination of the 5 platycosides in Platycodon radix with HPLC-ELSD method. Gradient elution（0-15min，20%-22%A；15-60 min，22%A；60-65 min，22%-30%A；65-70 min，30%-20%A）is carried out under the following conditions: ODS 250 silica gel as solid phase（250mm×4.6mm×5μm），acetonitrile -0.2% methanoic acid as mobile phase A，and water as mobile phase B；the test products are ultrasonically extracted with 50% methanol（ν/ν）for 30 min，filtered and dried by distillation before further dilution with 50% methanol（ν/ν）to a 5mL volumetric flask；and the drift tube is set at 75℃and the nitrogen flow rate 2.5 L/min. The compositionconcentrationshows agoodlinear relationshipwiththepeakareawhen deapioplatycoside E，platycoside E，platycodin D3，deapioplatycodin D and platycodin D are 0.64-6.4 μg，1.22-12.2 μg，1.08-10.8 μg，0.74-7.4 μg and 1.7-17 μg respectively. The average recoveries of the five ingredients are 101.1%，99.9%，100.4%，100.7% and 101.6% respectively. All the RSDs are lower than 5%. The method is simple，accurate and efficient，suitable for the quality control of Platycodonradix.

Keywords:Platycodon radix；Platycoside；HPLC-ELSD；gradient elution

通訊作者：徐小平（1962-），男，四川宜賓市人，副教授，碩士，主要從事藥品質(zhì)量控制研究。

作者簡(jiǎn)介：岳虹（1981-），女，四川成都市人，碩士研究生，專(zhuān)業(yè)方向?yàn)樗幬锓治觥?/p>

收稿日期：2015-07-12；收到修改稿日期：2015-09-10

doi：10.11857/j.issn.1674-5124.2016.01.012

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-5124（2016）01-0049-04