□ 翁 婕 昆明市第十二中學(xué)

從食品安全的角度分析PCR技術(shù)在致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

□ 翁 婕 昆明市第十二中學(xué)

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的不斷發(fā)展，溫飽問題已得到基本解決。與此同時(shí)，食品安全的現(xiàn)狀與人們期望不符的問題日益突出，已成為影響人們健康生活與幸福指數(shù)的重要因素之一。有效地解決食品安全問題，對(duì)于構(gòu)建和諧社會(huì)和實(shí)現(xiàn)偉大中國夢(mèng)都有著重要的促進(jìn)作用。2013年，中國社科院在全國3 1個(gè)省份進(jìn)行問卷調(diào)查，超過5 0%的受訪群眾對(duì)食品安全不滿意。因此，食品安全任重道遠(yuǎn)，解決食品安全問題迫在眉睫。

我國是一個(gè)有著500 0年悠久歷史的文明大國，從《舌尖上的中國》可看出，美食文化是我國博大精神的中華文化之一，確?！吧嗉馍系陌踩?，不僅事關(guān)人們的生命財(cái)產(chǎn)安全，也關(guān)乎我國文化的傳承與發(fā)揚(yáng)。

食品安全的概念

食品安全是指人們?nèi)粘Ｊ秤玫氖称凡坏弦?guī)定的營養(yǎng)要求，而且不會(huì)引發(fā)急性、亞急性、慢性中毒和諸如嘔吐、發(fā)燒、致癌等癥狀，具有最基本的無毒和無害特點(diǎn)。

2013年，習(xí)總書記強(qiáng)調(diào)，在食品安全上讓老百姓滿意是檢驗(yàn)政府執(zhí)政能力的重要因素。此外，我國地方政府陸續(xù)實(shí)行食品安全一票否決制，如安徽、廣東佛山、福建福州和四川達(dá)州等。由此可見，我國對(duì)食品安全的高度重視，并上升到戰(zhàn)略高度。

致病菌對(duì)食品安全的危害

常言道病從口入，說明危害人類健康的絕大多數(shù)疾病與食用的食品有關(guān)。其中，致病菌是導(dǎo)致食品安全隱患的主要因素。在美國，每年超過100 0萬的死亡病例是由致病菌所引起。而在我國，由致病菌引發(fā)的食品安全問題也十分嚴(yán)重，在2013年，僅上海市由致病菌引發(fā)的食物中毒事件超過180例。

常見的致病菌有李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸埃希菌和志賀氏菌等。這些致病菌通過食品進(jìn)入人體內(nèi)，通過毒素破壞體內(nèi)的細(xì)胞組織，并通過自身的不斷生長與繁殖引發(fā)炎癥等。例如，金黃色葡萄球菌可引起肺炎、腦膜炎、敗血癥等致命性疾病，大腸埃希氏菌會(huì)引起人們產(chǎn)生腹瀉等疾病，沙門氏菌會(huì)引發(fā)急性腸炎，而致賀氏菌不但可引發(fā)人們腹瀉還會(huì)導(dǎo)致痢疾等。由食源致病菌引發(fā)的疾病若未得到及時(shí)治療，會(huì)進(jìn)一步加劇甚至引發(fā)死亡。由此可見，食源病原菌給人們的生活帶來了嚴(yán)重的危害。

PCR技術(shù)的概念及特點(diǎn)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（Pol y merASeChAi nreACtion，PCR）的主要原理是通過擴(kuò)增特定序列的d NA，繼而增加d NA的含量，便于后續(xù)的基因測(cè)序。PCR技術(shù)具有精確、快速、高效等特點(diǎn)。精確性體現(xiàn)在PCR技術(shù)的特異強(qiáng)，在特定酶的專一酶解下，擴(kuò)增特定的序列；快速則體現(xiàn)在PCR技術(shù)的用時(shí)較短，每一次的循環(huán)時(shí)間在3 mi n左右；而高效則體現(xiàn)PCR技術(shù)較成熟，對(duì)目標(biāo)d NA的擴(kuò)增成功率較高。

隨著PCR技術(shù)的不斷成熟，其應(yīng)用越來越廣泛。如基因克隆、基因檢測(cè)、致病菌檢測(cè)和其他遺傳病的檢測(cè)等。PCR技術(shù)主要有以下3個(gè)步驟：（1）變性。將模板d NA在加熱的條件下分解成單鏈，一般加熱的溫度為9 0℃左右，不同的d NA模板要求的具體實(shí)驗(yàn)加熱溫度不同。（2）退火。將上述加熱溫度冷卻至5 5～65℃，將目標(biāo)引物與單鏈的模板d NA結(jié)合，形成d NA-引物整體。（3）延伸。d NA-引物在TAq酶的作用下，通過堿基配對(duì)的原理合成另一條鏈，從而形成一條完成的d NA雙鏈結(jié)構(gòu)。

PCR技術(shù)在致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

致病菌是威脅人類健康的重要因素，也是導(dǎo)致食品安全問題的罪魁禍?zhǔn)住Ｒ虼?，只有?zhǔn)確地檢測(cè)出食品中的致病菌，才能從源頭上監(jiān)管，實(shí)現(xiàn)防患于未然，充分保障人民的生命財(cái)產(chǎn)安全。當(dāng)前，PCR技術(shù)分為反轉(zhuǎn)錄PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)和免疫PCR技術(shù)等。

反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)

反轉(zhuǎn)錄PCR（ReverSEtrAnSCriPtionPCR，R T-PCR）又稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR，與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，該技術(shù)是利用致病菌組織中的R NA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cd NA。再以cd NA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到相應(yīng)的目標(biāo)d NA。張弛 等建立了沙門氏菌反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)方法，通過S-F/S-R引物、S-Prob e探針有效地檢測(cè)出沙門氏菌，并有效地避免了金黃色葡萄球菌等雜菌的干擾。

多重PCR技術(shù)

多重PCR是在傳統(tǒng)PCR的基礎(chǔ)上，增加多條引物，這些引物分別于相應(yīng)的目標(biāo)d NA單鏈結(jié)合，可一次性檢測(cè)出多種致病菌。該技術(shù)與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)在原理、方法、相應(yīng)的步驟上沒有變化，但在致病菌的檢測(cè)效率上大大提高，成本也降低不少。但該法也有一定的缺陷，多個(gè)菌落的同時(shí)檢測(cè)對(duì)實(shí)驗(yàn)要求嚴(yán)格，一旦變性溫度、退火溫度等條件不當(dāng)，就會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。KAwAsAkiS等根據(jù)沙門氏菌、大腸埃希氏菌和李斯特菌的基因分別設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，繼而實(shí)現(xiàn)肉類樣品中3種致病菌的同時(shí)檢測(cè)。

實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)

實(shí)時(shí)PCR技術(shù)是在PCR擴(kuò)增的過程中實(shí)現(xiàn)對(duì)致病菌的檢測(cè)目的，該技術(shù)利用目標(biāo)d NA的所反射的熒光強(qiáng)度與自身的量成正比，實(shí)現(xiàn)對(duì)致病菌的定量檢測(cè)。該法簡(jiǎn)化了后續(xù)的分析過程，大大地縮短了時(shí)間，給食品安全監(jiān)管帶來便利。唐振柱 等利用實(shí)時(shí)的熒光PCR技術(shù)檢測(cè)食品中的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌等，研究結(jié)果表明，該法可簡(jiǎn)單、快捷地檢測(cè)目的菌，可作為政府部門的有效技術(shù)支撐，有效處理重大食品安全事件。

免疫PCR技術(shù)

免疫PCR技術(shù)是酶聯(lián)免疫法與傳統(tǒng)PCR方法的結(jié)合，更具特異性和靈敏度。通過PCR擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)d NA的量化，連接擴(kuò)增后的d NA與抗原抗體，實(shí)現(xiàn)d NA的定量分析。曹娜娜利用免疫PCR技術(shù)檢測(cè)牛肉餡和牛奶中的致病菌，通過鏈霉親和素將目標(biāo)d NA嫁接與相應(yīng)抗體連接，通過擴(kuò)增固定的d NA模板，進(jìn)而快速地測(cè)出腸出血性大腸埃希菌O15 7∶H 7，比單一的酶聯(lián)免疫法精確100 0多倍。

結(jié)語

食品安全無小事，作為一項(xiàng)民生工程，食品安全與人們的生活密切相關(guān)。食品中的致病菌是人類健康的主要“殺手”，因此，準(zhǔn)確、快速、及時(shí)地檢測(cè)致病菌具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。而隨著PCR技術(shù)的不斷成熟，其檢測(cè)致病菌的成本也會(huì)大大降低，其高效及準(zhǔn)確的檢測(cè)特性使其在食品安全監(jiān)管等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。