●柴金珍 黃遠英 邱春媚 楊曉惠 李開瑩 殷光玲

抗疲勞實驗研究進展

●柴金珍 黃遠英 邱春媚 楊曉惠 李開瑩 殷光玲

目的：對國內(nèi)外抗疲勞作用研究的實驗模型和理化指標測定方法進行綜述。方法：按抗體力疲勞實驗模型、抗腦力疲勞模型、理化指標測定方法三個方面進行概述。結果：抗體力疲勞實驗模型研究除負重游泳實驗模型外，還有爬桿實驗模型、轉(zhuǎn)棒實驗模型、跑臺實驗模型、跳臺實驗模型、鼠尾懸掛實驗模型、耐缺氧存活實驗模型、肌肉收縮測定實驗模型等；抗腦力疲勞實驗模型還有Morris水迷宮實驗模型、水迷宮法模型、小鼠睡眠剝奪實驗模型、避暗箱法實驗模型；理化測定指標有血乳酸（BLA）、血尿素氮（BUN）、肝糖元/肌糖元、血糖（Glue）、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、ATP酶、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、睪酮(T)、皮質(zhì)酮、丙二醛(MDA)、白細胞（WBC）和血紅蛋白(HB)等。結論：研究抗疲勞作用的實驗模型及測定的指標眾多，建議對具體的抗體力疲勞或者抗腦力疲勞作用實驗研究作一個統(tǒng)一的判定標準。

抗疲勞作用；實驗模型；理化指標

1 前言

《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》規(guī)定，物品具有抗疲勞功能的標準：小鼠負重游泳實驗結果陽性，且按規(guī)定方法測定運動后小鼠血乳酸、血清尿素、肝糖元/肌糖元三項生化指標中任二項指標陽性，可判定改受試樣品具有緩解體力疲勞功能的作用[1]。查閱CNKI文獻，中藥抗疲勞的研究文獻眾多，但用于抗疲勞作用的實驗模型也是參差不齊，如：負重游泳實驗、爬桿實驗、轉(zhuǎn)棒實驗、跑臺實驗、跳臺實驗、鼠尾懸掛實驗、迷宮實驗、耐缺氧實驗等模型。物品的抗疲勞功能實驗并非完全按《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》中規(guī)定的方法進行研究，導致物品的抗疲勞功能研究是否有效于或者更好于保健食品規(guī)定的方法，存在一定的異議。同時，隨著物品抗疲勞作用機制的不斷研究、完善，抗疲勞功能實驗模型和測定指標的統(tǒng)一方法也需要發(fā)展與更新，這樣，未來評價判斷物品的抗疲勞試驗研究將會更加全面和統(tǒng)一。本綜述旨在對目前抗疲勞研究中所采用的抗疲勞實驗模型及生化指標作一整理，以期為抗疲勞功能實驗的方法研究提供一定的幫助。

2 抗運動疲勞實驗模型

2.1 力竭游泳實驗

（1）負重游泳試驗[2]在末次給藥1h后，將小鼠尾根部負荷10 %體重的鉛塊，放置于水溫為(25±1)℃，水深不低于30cm游泳箱中游泳，記錄小鼠開始游泳至力竭沉入水面下8s。不能浮出水面為止的時間，記錄小鼠自游泳開始至死亡的時間(常溫)。

（2）非負重游泳試驗[3]末次給藥后2 h，將小鼠放于(23±0.5)℃的水箱中，水深15cm，水面積43cm?31cm。小鼠放入至小鼠沉入水中不動1min以上，視為游泳時間。

2.2 爬桿實驗[4]

末次給藥后2 h后，將小鼠放在爬桿架的有機玻璃棒上，使其肌肉處于緊張狀態(tài)，記錄小鼠由于肌肉疲勞從有機玻璃上跌落下來的時間。第3次跌落時終止實驗，累計3次的時間作為爬桿時間。

2.3 轉(zhuǎn)棒實驗[2]

在正式進行轉(zhuǎn)棒測試前3 d，每天將各組小鼠置于轉(zhuǎn)棒疲勞儀中的轉(zhuǎn)速為40 r.min-1轉(zhuǎn)棒上，進行適應性訓練10 min。于末次給予受試藥1 h后，將各組小鼠置于40 r.min-1轉(zhuǎn)棒上，至小鼠從轉(zhuǎn)棒掉下為止，記錄各組小鼠的疲勞轉(zhuǎn)棒時間。

2.4 跑臺實驗[5-7]

（1）選用體重220～260g大鼠，采用根據(jù)Bed-ford大鼠體重/攝氧量，建立的回歸方程漸增負荷運動模型。按以下程度運動至力竭。第一級負荷：坡度0°，速度8.2 m/min，時間15 min；第二級負荷：坡度0°，速度15.0 m/min，時間15min；第三級負荷：坡度10°，速度19.3 m/min，相當于76%最大攝氧量，運動至力竭。運動時使用毛刷刺激其尾部，使其保持在跑道前1/3處，以保證運動強度。力竭標準，第三級負荷運動中，動物未能堅持本級負荷跑速，先后滯跑道后1/3處達3次以上，刺激驅(qū)趕無效。行為特征為呼吸急深及幅度大、腹臥位、垂頭、刺激后無反應。

（2）測定大鼠從開始運動至力竭運動所用時間為大鼠運動能力。大鼠跑步力竭測試，在電動跑臺上以35 m/min的速度，坡度為0°進行力竭跑，判斷力竭標準為四肢無力支持住身體、頭部低垂、電刺激后不能繼續(xù)正常奔跑。

2.5 跳臺實驗[8]

連續(xù)給藥30d，每日1次，給藥25 d后，除正常對照組外其余各組每天均腹腔注射陽性對照藥品，末次給藥1h后將小鼠放入跳臺適應3 min，然后立即通以36 V交流電，動物受到電擊，跳回平臺開始計時，記錄5 min內(nèi)小鼠第1次跳下平臺的時間(潛伏期)和5 min內(nèi)的錯誤次數(shù)，24 h重做測驗。

2.6 鼠尾懸掛實驗[9]

在實驗小鼠尾端1 cm的部位，將其粘貼在一水平木板上，木板離地10 cm以上，小鼠呈倒掛狀。懸尾兩側用板隔開小鼠視線，小鼠為克服不正常體位而掙扎活動，但在活動一段時間后，出現(xiàn)間隔性不動，顯示“疲勞、失望”狀態(tài)，計算6～8 min內(nèi)“不動時間”，并同時觀察大鼠掙扎幅度及抑郁狀態(tài)。

2.7 耐缺氧存活實驗[10]

取雄性小鼠40只，每組各為1O只，按照設計要求分組并給藥，連續(xù)灌胃28d，禁食12 h，末次給藥20 min后將各組小鼠分別放人盛有15 g鈉石灰的150 mL廣口瓶內(nèi)，用凡士林涂抹瓶口，保持密閉，記錄各組小鼠的5，10，15，20 min耗氧量、存活時間和死亡耗氧量。

2.8 肌肉收縮能力的測定[11-12]

（1）于末次給藥30 min后，給大鼠100 g/L水合氯醛(3.0 g/kg)腹腔注射行麻醉，待麻醉后取腹臥位固定，制作在體左側坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本和右側坐骨神經(jīng)一比目魚肌標本。選擇約10 cm長的細線縛于腓腸肌和比目魚肌肌腱，縛線一端連接于張力換能器懸梁臂上，將換能器同樣固定在支架上，令肌肉處于最大等張收縮的前負荷狀態(tài)；將張力換能器與RM一6240系統(tǒng)相連，保護刺激電極置于坐骨神經(jīng)干，描記波形并記錄數(shù)據(jù)。實驗中為了防止神經(jīng)肌肉干燥而涂抹液體石蠟，并將動物直腸溫度保持在37 ℃左右。小鼠組同樣于末次給藥30 min后，在小鼠尾部1/3～2/3處負重(體重的10%)后放入水深為22 cm的水槽中游泳。

（2）將蟾蜍雙毀髓后分離腓腸肌，去血污，在任氏液中浸泡穩(wěn)定10 min后使用。將同1只蟾蜍的2條腓腸肌標本隨機分成對照組和給藥組，給藥組浸在試樣中低速攪拌，浸泡20 min；對照組浸在任氏液中作同樣的處理。將股骨頭固定在屏蔽盒中，肌腱端的細線連于張力換能器上，使肌肉自然拉直，處于持續(xù)恒定的張力狀態(tài)。張力換能器的信號輸入RM6240B型多道生理信號采集處理系統(tǒng)(以下簡稱采集處理系統(tǒng))，刺激電極，輕觸肌肉表面，進行2種模式的電刺激，通過采集處理系統(tǒng)分別記錄每種模式下的肌肉收縮曲線。2種刺激參數(shù)分別為：①強度遞增刺激模式：強度0.5V，強度增量0.2V，波寬0.2ms，延時20 ms，組間延時4 S；②連續(xù)單刺激模式：刺激強度為最適刺激強度的1.5倍，波寬0.2 ms，延時20ms，頻率2.5Hz。

3 抗腦力疲勞實驗模型

3.1 Morris水迷宮實驗[13-14]

Morris發(fā)明了水迷宮實驗來測量空間學習和記憶能力，用于評估嚙齒動物由于衰老、藥物和外傷等因素所造成對運動和精神系統(tǒng)的影響。該裝置使用簡便易學，目前已被認為是此類研究的經(jīng)典方法。Morris水迷宮實驗主要包括兩個實驗，隱蔽平臺實驗和空間探索實驗。實驗在隔音安靜的房間內(nèi)進行，水溫控制在22.5 ℃±0.5℃，前1 d將小鼠放入水中自由游泳2 min以熟悉環(huán)境。水是嚙齒動物厭惡的環(huán)境，因此，當其達到平臺后，會迅速記憶周邊參照物。隱蔽平臺實驗時，從東、西、南、北四個象限隨機選擇作為入水點，按順時針方向?qū)⑿∈竺嫦虺乇诜湃胨?，記錄大鼠從入水至爬上平臺的時間(即逃避潛伏期)、游泳路程、平均游泳速度及搜索模式。若120 s內(nèi)未找到平臺，則由實驗者用手引導其至平臺，并停留相同時間逃避潛伏期記為120 s。實驗7 d后，進行空間探索實驗，將平臺移除。隨機選擇一入水點，將小鼠置于水中游泳60 s，期間測量跨平臺次數(shù)、目標象限游泳時間、目標象限游泳時間與總時間之比、平均游泳速度、游泳路程及搜索模式。每次完成后用毛巾或烘干器使小鼠體溫維持正常，避免由低體溫所致的應激。

水迷宮法[8]連續(xù)給藥30 d，每日1次，25d給藥后，除正常對照組外其余各組每天均腹腔注射1.25 mg/kg東莨菪堿注射液，末次給藥后，次日開始測試5 d，第1次測試前將小鼠放在梯子附近，使其自動爬上3次。水迷宮全程共5個錯誤記錄點，第1天從倒數(shù)第2個錯誤點處開始計時，第2天從倒數(shù)第3個錯誤點處開始計時，第3天從倒數(shù)第4個錯誤點處開始計時，第4天和第5天從迷宮起點開始計時，每天連續(xù)測試3次，記錄第3次到達終點的時間。連續(xù)測試5d，最后累計每只小鼠在5d測試期間到達終點的時間，以此作為學習成績。

3.2 小鼠睡眠剝奪模型[2]

采用單平臺水環(huán)境法(SPM)，即在每個鼠籠中央設置一個直徑約為2.5cm，高約為4.0 cm的平臺，鼠籠內(nèi)注水，水面低于平臺1 cm。將一只小鼠放置在平臺上，小鼠可以在平臺上站立，也可進入正相睡眠即非快速眼球運動睡眠(NREM)。但當小鼠進入異相睡眠即快速眼球運動睡眠(REM) 時，全身骨骼肌張力明顯降低，頸部肌張力降低引起節(jié)律性低頭、觸水、清醒，從而無法進入REM，就此達到睡眠剝奪的目的。

3.3 避暗箱法[15]

利用小鼠喜好鉆黑洞的習性，設計明、暗相連的兩箱，兩箱間隔板底留一孔洞，暗箱底部鋪設帶電銅柵。末次用藥后1h開始訓練小鼠學習記憶能力。訓練前20 min，每組腹腔注射氫溴酸東莨菪堿2mg/kg，造成記憶缺損模型，對照組注射等量的生理鹽水。測定時將動物放入明箱，小鼠一鉆入暗箱立即受到電擊，而返回明箱，從而獲得記憶。記錄小鼠自放入明箱到鉆洞進入暗箱的潛伏期以及5 min內(nèi)進入暗箱的鉆洞次數(shù)。5 min內(nèi)未鉆洞者，潛伏期按300 s計算，其結果均由計算機自動記錄。

4 生理指標

4.1 乳酸（BLA）[16]

末次給予受試樣品30min后，各采血20uL加入40 uL破膜液中，立即充分振蕩破碎細胞，同時將采血后動物置于溫度為30℃的水中不負重游泳，10min后停止，游泳后立即采血20uL加入40uL破膜液中振蕩，休息20min后再采血20uL加入40uL破膜液中振蕩，用乳酸儀測定各樣品血乳酸值。

4.2 血清尿素氮（BUN）[17]

在末次訓練后稱重，用乙醚適度麻醉，摘眼球采血，加入檸檬酸鈉溶液抗凝，37℃水浴中30 min后，4℃3000 r.min-1離心10min，分離制備血清。血清尿素采用UV-GLDH法測定。

4.3 肝糖元/肌糖元[17]

在末次訓練后稱重，用乙醚適度麻醉，迅速取肝臟、雙側睪丸和深層股四頭肌，剔除筋膜，置于預冷的生理鹽水中洗凈血污，再用濾紙吸干后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。組織勻漿的制備：稱取適量組織(0.2～1 g)按m(g)組織塊質(zhì)量/V(mL)勻漿介質(zhì)為1/9的比例加取預冷的勻漿介質(zhì)(0.9%的NaCl溶液)于燒杯中，迅速剪碎組織塊(以上全部操作在冰水浴中進行)。勻漿經(jīng)3000 r.min-1低溫離心15 min，分離提取上清液，在4℃冰箱冷藏即用或20℃冰箱冰凍備用。肝糖原、肌糖原采用化學比色法測定。

4.4 血糖（Glue）[18]

末次給藥運動后，輕度麻醉大鼠并用眼眶采血，制備血清血糖。血糖含量測定采用鄰甲苯胺法。

4.5 睪酮（T）、血清皮質(zhì)酮、黃體生成素、卵泡刺激素[17]

同“4.2項”血清睪酮、血清皮質(zhì)酮、黃體生成素和卵泡刺激素采用放射免疫分析法測定。

4.6 白細胞（WBC）和血紅蛋白(HB)[19]

末次給予樣品30 min后，將小鼠放入30℃水中不負重游泳90min，取出，分別于游泳后1h、24 h和72 h取小鼠尾血10uL于2mL血細胞分析儀稀釋液中，用血細胞分析儀檢測白細胞和血紅蛋白基礎值。

4.7 丙二醛（MDA）腦組織MDA[20]

末次訓練后24 h測定腦組織中MDA。處死時均采用戊巴比妥鈉65 mg/kg麻醉，斷頭處死，立即開顱，迅速取出全腦，浸入冰生理鹽水中洗凈殘余血液，濾紙吸干，用剪刀剪下約0.3-0.4 g腦組織，用電子天平稱重，按l：9(質(zhì)量分數(shù))加入冰冷的生理鹽水，冷環(huán)境中勻漿制成質(zhì)量分數(shù)為10%的腦組織勻漿液，低溫離心(2000 r/min)20 min，取上清液于樣品管中待測。采用比色法測定MDA含量。

肝組織中MDA[21]小鼠造模后處死，精確稱取固定部位肝組織，以9 mg/mL NaC1溶液沖洗后用濾紙吸干。準確稱量0.5 g置于試管中，加入5 mL預冷的9 mg/mL NaC1溶液于試管中。用組織勻漿機制成0.1g/mL的勻漿。3500 r/min離心115 min，取上清，測定MDA含量。

血清中MDA[22]末次灌胃1 h后，各組取10只小鼠，置于水深30 cm，水溫25.0±2.0℃的水桶中游泳90min，立即摘眼球取血，分離血清，用分光光度法按照丙二醛測定試劑盒說明檢測MDA含量。

4.8 谷胱甘肽過氧化物酶(GSH—PX)腦組織中GSH-PX[20]

同“4.7項腦組織中MDA”制備組織勻漿，采用化學比色法測定GSH—Px。

血清中GSH-PX[22]同“4.7項 血清中MDA”制備血清，采用胱甘肽過氧化物酶試劑盒說明檢測GSH-PX活力。

4.9 超氧化物歧化酶（SOD）腦組織中SOD[20]

同“4.7項 腦組織中MDA”制備組織勻漿，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力。

肝組織中SOD[21]同“4.7項 肝組織中MDA”制備組織勻漿，測定SOD 的含量。

血清中SOD[22]同“4.7項 血清中MDA”制備血清，用超氧化物歧化酶試劑盒說明檢測總SOD活力。

4.10 肌酸激酶(CK)[19]

末次給予樣品30min后，將小鼠放入30℃水中不負重游泳90min，取出，休息60min后摘眼球采全血約0.5mL。置4℃冰箱約3h，血凝固后2000r/ min離心15min，取血清用生化分析儀檢測CK含量。

4.11 乳酸脫氫酶（LDH）[23]

小鼠末次灌胃30min后，各組小鼠置于30℃的游泳箱中不負重游泳50min后采眼球血。用乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒測定酶活力。

4.12 ATP酶[24]

小鼠眼靜脈叢取血后，取心臟、股四頭肌組織，濾紙吸干后，稱重，冰上勻漿處理，按ATP酶試劑盒說明書進行。

5 小結

目前，雖然抗疲勞研究方法眾多，但存在有以下三個方面的問題需要解決：（一）抗腦力疲勞實驗沒有標準模型?！侗＝∈称窓z驗與評價技術規(guī)范》中的抗疲勞模型標準適用于評價抗運動性疲勞作用，對評價抗腦力疲勞作用無效。（二）綜合上述抗疲勞實驗模型和生化指標可知，抗疲勞作用不止于僅對負重游泳實驗、肝糖元/肌糖元、血尿素氮、血乳酸五個方面的數(shù)據(jù)測定，這與抗疲勞作用機制研究不斷取得進步有關[25]。研究得到抗疲勞作用機制包括：調(diào)節(jié)能量代謝、降低代謝產(chǎn)物、抗氧化作用、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、增強免疫力等。目前，抗疲勞的研究實驗和生化指標主要集中于力竭游泳實驗，測定肝糖元/肌糖元、血尿素氮、血乳酸、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙二醛、睪丸酮、血清皮質(zhì)酮、白細胞、血紅蛋白等。抗疲勞作用評價標準有待進一步統(tǒng)一。（三）提高耐缺氧耐受力已列為二十七項保健食品功能之一，缺氧實驗模型是否可以作為抗疲勞

（作者單位：湯臣倍健股份有限公司）

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The Research Progress of Anti-fatigue Experiment

CHAI Jin-zhen, HUANG Yuan-ying, QIU Chun-mei, YANG Xiao-hui, YING Guang-ling?(By-health Co.,LTD, Guang Zhou,510663, Guang Dong, China )

Objective To review the experimental model、the physical and chemical indicators of the anti-fatigue effect study at home and abroad. Methods According to physical fatigue resistance experiment model, mental fatigue resistance experiment model, determination method of the physical and chemical index, three aspects are summarized. Results In addition to the weight loading swimming experiment model in the physical fatigue resistance experiment model research, there are climbing pole experiment model, stick model, running platform, rat tail suspension experiment model, hypoxia survival model, muscle contraction force measurement model, etc. There are four experiment models in the study of mental fatigue resistance： Morris water maze experiment model, the water maze method model, sleep deprivation experiment model and avoiding the “black box” experiment. A lot of physical and chemical indices are measured in the study of anti-fatigue, such as blood lactic acid (BLA), blood urea nitrogen (BUN), glycogen yuan/muscle glycogen, blood sugar (Glue), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSHPX), ATP enzyme, creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), testosterone (T), cortisol, malondialdehyde (MDA), white blood cells (WBC) and hemoglobin (HB), etc. Concludes The experimental models and determination of physical and chemical indices of anti-fatigue effect are numerous, so a unified standard about specific physical or mental fatigue resistant fatigue resistance experiment is adviced.

Anti-fatigue effect; experimental model; physical and chemical indicator