俞越錢（浙江工業(yè)大學化學工程學院，浙江　杭州310014）

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牛乳清結晶條件的探索及其結晶體形貌

俞越錢
（浙江工業(yè)大學化學工程學院，浙江杭州310014）

摘要：以脫脂及去酪蛋白的牛乳清為原料，利用紫外分光光度法及SDS-PAGE電泳技術，在pH 4.7～8.0，NaCl濃度0.5～2.0 mol/L條件下，對其結晶情況進行了研究。結果表明：牛乳清蛋白中的免疫球蛋白G（IgG）是一種理想的目標蛋白，而pH 7.0則是得到IgG的理想pH。最后還利用了工業(yè)相機及熒光倒置顯微鏡對牛乳清結晶體進行了拍攝，發(fā)現(xiàn)其中主要有長方晶、四角晶、菱方晶三種結晶體形貌。

關鍵詞：牛乳清；結晶；結晶體形貌；免疫球蛋白

乳清蛋白是牛奶中重要的一類蛋白，其中主要包括IgG、乳鐵蛋白、乳過氧化物酶、牛血清蛋白（BSA）等[1]，研究[2]表明：牛乳清中各類蛋白均具有一定的生物活性和功能，所以分離乳清蛋白成了至關重要。

層析是一種分離乳清蛋白的重要手段[3]，但是從工業(yè)角度來講，層析過程主要有兩個弊端：第一是設備成本高;第二是操作難度大。因此，找一種方法對工業(yè)層析過程做補充是有意義的。而結晶就是一種能補充層析的方法[5]。為此，要利用結晶方法得到乳清蛋白，首當其沖的問題就是選擇合適的結晶條件。

結晶過程的條件一般包括結晶劑、pH、溫度、攪拌速度等[6]。其中，結晶劑可為鹽[7-8]或有機試劑[9]。對于蛋白質(zhì)體系，NaCl是一種最常見的結晶添加物[10]，而且層析的洗脫過程中往往也要引入NaCl，它是一種常見的洗脫劑。那么，為了能與層析過程做對接，且不引入其他物質(zhì)致使體系更為復雜，本工作將NaCl作為牛乳清結晶劑。同時pH也是重要的條件之一，pH對乳清蛋白濃縮物（WPCs）的影響前人做過一些研究，如Lucena[12]和Bramaud[13]都利用了等電點沉淀法得到了WPCs中的α-乳白蛋白，沉淀中還含有少量的BSA以及免疫球蛋白（Igs）。顯然，在探索pH的影響時關注乳清蛋白的等電點對于本工作是非常必要且十分重要的。

目前為止，研究pH和鹽濃度對天然牛乳清體系結晶行為的影響還鮮有前人的文獻記載。本工作就將針對牛乳清體系，圍繞這兩個變量展開研究與討論。最后還拍攝了牛乳清中的結晶體晶型。

1　實驗部分

1.1主要試劑

實驗所用的牛奶來自蕭山牧場。BSA向德國Sigma-Aldrich公司購買。鹽酸，杭州雙林化工試劑廠，分析純。氫氧化鈉，杭州蕭山化學試劑廠，分析純。氯化鈉，上海申博化工有限公司，分析純。

1.2主要儀器

低溫恒溫槽（SC-15），寧波天恒儀器廠；紫外分光光度計（Ultrospec 3300 pro），Amersham Bioscience；SDS-PAGE電泳槽（Mini Protean 3 Cell），Bio-Rad。分析天平（BS 224 S），賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；大恒工業(yè)相機（DH-HV3103UC-T），北京大恒圖像視覺有限公司；熒光顯微鏡（CFM-500E），上海長方光學儀器有有限公司。實驗裝置如圖1。

圖1　牛乳清結晶實驗裝置示意圖Figure.1 Crystallization experiment setup of bovine whey

1.3實驗過程

1.3.1牛奶處理

將鮮牛奶在5000 r/min下離心30 min脫去脂肪，然后將其調(diào)至酪蛋白的等電點（pI）為4.6，在35℃的水浴恒溫加熱磁力攪拌器中溫浴攪拌50 min，使酪蛋白沉淀完全，將脫脂乳同樣在5000 r/min下離心30 min除去酪蛋白沉淀。最后乳清的pH調(diào)至5.8，并利用0.45 μm的微濾膜過濾。

1.3.2牛乳清結晶與分析

配成一定pH（4.7，5.8，7.0，8.0），NaCl濃度（0.5 mol/L，1.0 mol/L，1.5 mol/L，2.0 mol/L）的25 mL牛乳清。取15 mL該牛乳清放入100 mL的燒杯中，并將其置于低溫恒溫槽中降溫結晶。該降溫過程分為三個階段，恒溫，降溫，平衡。降溫速度分為兩種，先以0.1℃/min降溫，等接近成核點時利用0.01℃/min降溫，直至析出晶體。最后利用1 mL的移液槍取上清液至1.5 mL離心管中保存。接著利用BSA標準曲線得到各上清液蛋白質(zhì)的量。最后取稀釋后的上清液80 μL至20 μL的上樣緩沖液（Loading buffer）中，利用100℃的水浴煮沸，接著做電泳，最后染色，脫色，拍照。

1.3.3牛乳清晶體拍攝

首先，將工業(yè)相機安裝于熒光顯微鏡上，接著調(diào)試顯微鏡焦距，最后對牛乳清溶液結晶體進行拍攝。

2　結果與討論

2.1NaCl濃度和pH對成核溫度的影響

圖2是在不同pH下，成核溫度隨NaCl濃度改變的曲線。由圖可知，成核溫度會隨著鹽濃度的增加而增加，也就是說鹽濃度越高，牛乳清就越容易析出蛋白質(zhì)。這種現(xiàn)象可以用Curtis等人[11]的蛋白質(zhì)-鹽相互作用理論來解釋。并且它與Alderton[7]對雞蛋清溶菌酶和Visuri[8]對淀粉酶的工作中出現(xiàn)的現(xiàn)象相類似。

圖2　不同pH下成核溫度隨鹽濃度的變化Figure.2 Temperature of nucleation versus NaCl concentration under different pH

圖3是不同NaCl濃度下，成核溫度隨pH改變曲線。由圖可知，在鹽濃度為0.5～1.5 mol/L，pH 7.0時最容易成核。但是在鹽濃度為2.0 mol/L時，成核溫度會隨著pH的增大而增大，并在pH 7.0之后趨于平緩。這也許是因為牛乳清中蛋白的主要成分是IgG，而IgG的等電點是7.0[4]。所以在pH 7.0時析出的蛋白最多是比較合理的。而在高鹽濃度下，這種現(xiàn)象會被弱化。所以在2.0 mol/L鹽濃度下會出現(xiàn)這樣的趨勢。

圖3　不同鹽濃度下成核溫度隨pH的變化Figure.3 Temperature of nucleation versus pH at different NaCl concentration

2.2NaCl濃度和pH對蛋白質(zhì)結晶量及收率的影響

圖4（a）和圖4（b）分別表示的是牛乳清中析出的蛋白質(zhì)的量隨鹽濃度的變化以及牛乳清中析出蛋白質(zhì)的回收率隨鹽濃度的變化。由于每次牛乳清結晶實驗都是取15 mL牛乳清，所以上述蛋白質(zhì)的析出量以及產(chǎn)率都是以15 mL牛乳清為基準的。從圖4（a）中可以看出乳清蛋白的析出量會隨著鹽濃度的升高而升高。而在圖4（b）中也有與圖4（a）相同的趨勢，從圖4（b）圖不難發(fā)現(xiàn)蛋白的最大析出量小于55 %，這主要有兩方面原因，一方面是因為平衡時間較短（0.5 h）。另一個原因是蛋白與水之間的作用力在一定階段后要大于蛋白與蛋白之間的作用力以及蛋白與鹽之間的作用力[24]，這樣就會影響蛋白之間的成團。

圖4?。╝）

圖4　（b）Figure.4

圖5（a）和圖5（b）分別表示牛乳清中析出的蛋白質(zhì)的量隨pH的變化以及牛乳清中析出蛋白質(zhì)的回收率隨pH的變化（以15 mL牛乳清為基準）。從圖5（a）中可以看出pH 4.7和7.0時要比另外兩個pH時的析出量大，這是因為BSA和IgG是牛乳清中含量最高的兩種蛋白，而兩種蛋白的等電點分別是4.7以及7.0。

圖5　（a）

圖5?。╞）Figure. 5

2.3NaCl濃度和pH對牛乳清中各蛋白含量的影響

圖6（a）和圖6（b）表示不同NaCl濃度和pH下牛乳清析出蛋白后上清液的SDS-PAGE電泳圖。從圖6（b）顯然可見，在pH 7.0時隨著鹽濃度的增加，IgG的量在明顯減小。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)是因為IgG的等電點在7.0左右，這時它最易沉聚析出。但如圖6（a），在pH 4.7時BSA并沒有出現(xiàn)類似于IgG的現(xiàn)象。

2.4牛乳清結晶體形貌

牛乳清是復雜的蛋白質(zhì)體系，為了能夠更好地利用結晶方法從牛乳清中得到蛋白質(zhì)，對牛乳清中結晶體晶型的觀察是必不可少的。

圖6?。╝）

圖6　（b）Figure.6

圖7　Figure. 7

如圖7（a）和圖7（b）中出現(xiàn)的是長方晶，而圖7（c）中則是四角晶。這兩種晶型在蛋白質(zhì)結晶中是比較常見的。如雞蛋清溶菌酶在溶液結晶中會出現(xiàn)兩種典型的晶型[4]，一種是四角晶，另一種是長方晶。而圖（d）出現(xiàn)的是菱方晶。之所以會出現(xiàn)不同的結晶體形貌是因為蛋白質(zhì)是大分子物質(zhì)，其空間構象十分復雜且易變。而在牛乳清體系中，不同作用力包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)作用力和鹽-蛋白質(zhì)作用力的共同作用下，蛋白質(zhì)構象將變得更為復雜，這樣導致了結晶體晶格堆疊的過程中其長出晶體形貌的不確定性的增加，最后才出現(xiàn)了這幾種不同的晶體形貌。

3　結論

本工作以脫除脂肪以及酪蛋白的牛乳清為原料，研究了pH以及NaCl濃度對其結晶的影響。發(fā)現(xiàn)IgG是一種理想的牛乳清結晶目標蛋白，而pH 7.0則是得到這種目標蛋白的理想pH。

最后還觀察到牛乳清中能得到四角晶、長方晶、菱方晶等三種結晶體形貌。

參考文獻：

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Exploration of Bovine Whey Crystallization Conditions and Morphology of Proteins Crystals

YU Yue-qian
（College of chemical engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou，Zhejiang 310014, China）

Abstract:With UV spectrophotometry and electrophoresis, degreased bovine whey after removal of casein was studied in conditions of pH 4.7～8.0 and 0.5～2.0 mol/L NaCl. The results showed that immunoglobulin（IgG) was a kind of ideal target protein in bovine whey. Meanwhile, pH 7.0 was the ideal pH to obtain IgG. Finally, the crystallization behavior of whey was surveyed by an inverted fluorescence microscope and a high resolution digital camera. Furthermore, three kinds of morphology including orthorhombic, tetragonal and rhombus crystals were observed.

Keywords:bovine whey; crystallization; morphology of crystals; immunoglobulin

作者簡介：俞越錢（1990—），男，浙江紹興人，碩士研究生，主要研究方向為分離工程。E-mail:yyqsxf@163.com。

收稿日期：2015-05-22

文章編號：1006-4184（2016）1-0026-05