●陸敏麗

地中海貧血實(shí)驗(yàn)診斷的研究進(jìn)展

●陸敏麗

貧血是現(xiàn)代人所面臨的主要血液疾病之一，其中地中海貧血癥在我國(guó)的發(fā)病幾率較高，目前仍無(wú)針對(duì)性的治愈模式，但早發(fā)現(xiàn)早治療仍然可以最大限度地保證患者的生命健康。本文即是對(duì)地中海貧血癥的實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)進(jìn)展進(jìn)行研究，首先介紹了地中海貧血的概念，并對(duì)篩查法和基因診斷兩種實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)的進(jìn)展進(jìn)行闡述，以期能為相關(guān)工作提供參考。

地中海貧血；實(shí)驗(yàn)診斷；技術(shù)進(jìn)展

基因是決定生物體生理功能的重要因素，也是一切生物進(jìn)化的基礎(chǔ)，一旦基因發(fā)生改變就會(huì)影響生物體的功能和生存狀態(tài)，其中絕大多數(shù)的基因改變均會(huì)給生物體造成負(fù)面影響，并且會(huì)遺傳給后代。地中海貧血癥是典型的遺傳性疾病之一，也是溶血性貧血癥的一種，給人體帶來(lái)的危害性極強(qiáng)，如果未開(kāi)展及時(shí)的診斷和治療，可能會(huì)導(dǎo)致患者死亡，而實(shí)驗(yàn)診斷是目前針對(duì)地中海貧血癥準(zhǔn)確率較高的診斷技術(shù)。

1 地中海貧血癥的概述

地中海貧血癥最早在1925年發(fā)現(xiàn)，由于發(fā)現(xiàn)地點(diǎn)位于地中海地區(qū)，因此而命名，目前其在我國(guó)貧血癥中的發(fā)生率也較高，尤其是在廣東、廣西、四川等南方地區(qū)。該疾病是由于人體常染色體存在遺傳性的缺陷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)珠蛋白鏈無(wú)法正常合成，表現(xiàn)為單一或多種珠蛋白缺乏，使得血紅細(xì)胞更容易被血漿所溶解，因此地中海貧血癥也屬于溶血性貧血的一種。在健康人群的血紅細(xì)胞當(dāng)中，合成珠蛋白需依靠4條肽鏈，分別是α、β、γ、δ，其分別由細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的基因編碼合成，如果編碼基因缺失或突變，就導(dǎo)致了蛋白質(zhì)肽鏈無(wú)法合成，珠蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，也就無(wú)法發(fā)揮其原有的功能，由此也可將地中海貧血癥分為四個(gè)種類(lèi)，其中發(fā)病率最高的為β型地中海貧血癥[1]?；疾≌叩呐R床表現(xiàn)為肝脾腫大、血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)異常下降、黃疸、發(fā)育不良、眼距增大、前額突出等，而且其骨骼造血功能異常活躍，使得骨髓腔直徑增加，骨質(zhì)厚度相對(duì)降低，易引發(fā)長(zhǎng)骨骨折性病變，少數(shù)患者還會(huì)出現(xiàn)膽囊結(jié)石、下肢潰瘍或心包炎等病變，大多數(shù)患者均可生活到成年，但病情嚴(yán)重的新生兒在出生后不久就會(huì)死亡，因此及早的診斷能夠?yàn)榛颊呲A得更多的治療時(shí)間[2]。

2 地中海貧血癥的篩查實(shí)驗(yàn)診斷研究進(jìn)展

雖然目前對(duì)于重癥地中海貧血的治愈仍存在問(wèn)題，但隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷進(jìn)步，越來(lái)越多的患者病情得到了緩解，而這也要?dú)w功于及時(shí)準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)。其中篩查實(shí)驗(yàn)技術(shù)不僅操作簡(jiǎn)單，而且診斷費(fèi)用更低，可應(yīng)用于婚檢的男女雙方、孕前和產(chǎn)前檢查的夫婦雙方當(dāng)中，達(dá)到預(yù)防地中海貧血患兒出生的優(yōu)生目的。根據(jù)篩查對(duì)象的不同可分為兩種方式，分別是血液常規(guī)檢查、血紅蛋白檢查，具體如下：

2.1 血液常規(guī)實(shí)驗(yàn)診斷進(jìn)展

血常規(guī)實(shí)驗(yàn)診斷是臨床診斷中較為常用的技術(shù)之一，也是地中海貧血癥篩查中必須開(kāi)展的一項(xiàng)檢查，其中以血細(xì)胞計(jì)數(shù)診斷為主，利用計(jì)數(shù)儀可對(duì)臍帶血中血紅細(xì)胞、白細(xì)胞等的數(shù)量和形態(tài)進(jìn)行檢查，其中血紅細(xì)胞數(shù)量減少、體積降低（平均體積低于79FL）、血紅蛋白含量下降（平均含量低于27pg）是懷疑為地中海貧血癥的主要依據(jù)[3]。

同時(shí)對(duì)紅細(xì)胞膜滲透脆性的實(shí)驗(yàn)檢查也是診斷依據(jù)之一，其主要是利用不同滲透壓濃度下紅細(xì)胞膜對(duì)于外界物質(zhì)滲透的抵抗能力進(jìn)行測(cè)試，也就是對(duì)血紅細(xì)胞發(fā)生溶解的臨界值進(jìn)行診斷，該臨界值也代表了血紅細(xì)胞表面積與體積之間的比例。如血紅細(xì)胞膜的滲透脆性較低，則說(shuō)明細(xì)胞膜對(duì)于外界滲透壓的抵抗能力較低，容易導(dǎo)致外界物質(zhì)大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使得細(xì)胞體積膨脹而發(fā)生破裂，引發(fā)溶血性貧血病變。根據(jù)現(xiàn)代研究證明地中海貧血患者血紅細(xì)胞存在不同程度的形變和滲透脆性的減弱情況，因此該實(shí)驗(yàn)診斷具有科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)支持[4]。

2.2 血紅蛋白實(shí)驗(yàn)診斷進(jìn)展

根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示，地中海貧血癥患者血液中血紅蛋白存在明顯的不穩(wěn)定性，這主要是由于珠蛋白合成障礙使得血紅蛋白本身結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致了性質(zhì)的不穩(wěn)，在實(shí)驗(yàn)診斷當(dāng)中可利用異丙醇沉淀法，即將實(shí)驗(yàn)溫度控制在37℃下，異丙醇溶液濃度控制在17%，此時(shí)將患者血紅蛋白樣本加入其中，如5min后出現(xiàn)沉淀、20min后出現(xiàn)絮狀物質(zhì)，則說(shuō)明樣本中存在不穩(wěn)定的血紅蛋白，可懷疑該患者具有地中海貧血癥

[5]。

同時(shí)還可以根據(jù)包涵體生成量測(cè)定法進(jìn)行診斷，其利用了不穩(wěn)定血紅蛋白和煌焦油藍(lán)等試劑反應(yīng)后產(chǎn)生的特殊包涵體為依據(jù)，在溫度為37℃的環(huán)境下進(jìn)行恒溫孵化，如2h內(nèi)出現(xiàn)了數(shù)量較多的包涵體（以α型地中海貧血癥最多），則說(shuō)明患者具有地中海貧血癥，該實(shí)驗(yàn)診斷方法操作簡(jiǎn)單，但相比于異丙醇沉淀法所需要的檢測(cè)時(shí)間更長(zhǎng)。

還可以利用血紅蛋白電泳診斷技術(shù)，因?yàn)槿梭w內(nèi)所有的血紅蛋白的等電點(diǎn)均在7以下，在pH=8.5的鹽環(huán)境當(dāng)中帶有大量的負(fù)電荷，如果此時(shí)環(huán)境中具有一個(gè)電場(chǎng)的作用力，則血紅蛋白就會(huì)以不同的速度相陽(yáng)極移動(dòng)，通過(guò)其移動(dòng)速度就可以判斷血紅蛋白的穩(wěn)定性。加之利用醋酸纖維薄膜，可定量地分析不穩(wěn)定血紅蛋白，確定地中海貧血癥的發(fā)病程度。根據(jù)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中所使用的電泳介質(zhì)不同可分為毛細(xì)管、Hb瓊脂糖等，該實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、準(zhǔn)確率高、樣本消耗量低等諸多特征，在孕婦妊娠期檢測(cè)中應(yīng)用范圍較廣，其中Hb瓊脂糖診斷可借助全自動(dòng)檢測(cè)儀完成，使得診斷時(shí)間進(jìn)一步縮減，并且定量定性檢測(cè)更加準(zhǔn)確，所獲得的電泳圖譜可永久性保存，但在實(shí)際應(yīng)用時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陰性的情況，因此如患者異丙醇沉淀呈陽(yáng)性，則需要結(jié)合醋酸纖維薄膜檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合分析。

3 地中海貧血的基因?qū)嶒?yàn)診斷研究進(jìn)展

地中海貧血癥本身是由于常染色體內(nèi)基因變異或缺失所引發(fā)的病癥，因此利用基因?qū)嶒?yàn)診斷技術(shù)能夠更加準(zhǔn)確地判斷患者的病癥。我國(guó)最早利用基因?qū)嶒?yàn)診斷地中海貧血癥的技術(shù)為DNA點(diǎn)雜交技術(shù)，后隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步又發(fā)展出了限制性?xún)?nèi)切酶譜系診斷技術(shù)、寡核苷酸探針雜交、聚合鏈酶反應(yīng)體外擴(kuò)增、芯片技術(shù)等，其中聚合鏈酶反應(yīng)技術(shù)目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用范圍更大。

3.1 限制性?xún)?nèi)切酶譜系診斷技術(shù)

根據(jù)生物體DNA的特點(diǎn)，利用限制性?xún)?nèi)切酶可以有效地識(shí)別和切割DNA上特定的序列，從而獲得長(zhǎng)度已定的片段，但是如果DNA的堿基發(fā)生變異，就會(huì)導(dǎo)致其上內(nèi)切位點(diǎn)喪失，使得限制性?xún)?nèi)切酶切割后的DNA片段長(zhǎng)度發(fā)生變化，從而確定人體內(nèi)是否存在變異的基因序列。這種實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)的準(zhǔn)確性非常高，基本不存在假陰性的情況，但其無(wú)法診斷被檢測(cè)對(duì)象基因突變的具體情況，而且對(duì)操作人員技術(shù)的要求較高，即使明確了檢測(cè)對(duì)象存在基因突變的病癥，但無(wú)法確診為地中海貧血癥，因此可將其作為準(zhǔn)確輔助診斷數(shù)據(jù)之一[6]。

3.2 探針斑點(diǎn)雜交技術(shù)

該診斷技術(shù)主要依據(jù)DNA序列互補(bǔ)原則，以引物來(lái)擴(kuò)增診斷對(duì)象珠蛋白的基因鏈，并合成與突變序列相互互補(bǔ)的DNA序列，利用尼龍膜作為載體，分別就正常基因和變異基因的雜交探針進(jìn)行對(duì)比標(biāo)記，如雜交探針不完全與正常基因互補(bǔ)，則可以在一定條件下進(jìn)行洗脫，可直接利用發(fā)射自顯影技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)診斷結(jié)果進(jìn)行觀察。該項(xiàng)診斷技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于操作時(shí)間更短，且診斷結(jié)果的靈敏性更高，但其對(duì)于目標(biāo)DNA的準(zhǔn)確性和純度要求也較高，因?yàn)橐坏┧x擇的突變DNA錯(cuò)誤，就會(huì)導(dǎo)致合成的互補(bǔ)鏈錯(cuò)誤，實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)任何意義，目前我國(guó)將其主要應(yīng)用在β型地中海貧血癥診斷當(dāng)中。

3.3 聚合鏈酶反應(yīng)診斷技術(shù)

我國(guó)所應(yīng)用的地中海貧血基因診斷技術(shù)中聚合鏈酶反應(yīng)技術(shù)的范圍最大，其可以在體外環(huán)境下開(kāi)展擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，從而降低了對(duì)DNA片段選擇的難度，根據(jù)所使用的聚合鏈酶反應(yīng)技術(shù)不同可分為多種形式。多重聚合鏈酶反應(yīng)技術(shù)是其中之一，該技術(shù)下包含了四對(duì)等位基因的引物，根據(jù)每對(duì)等位基因引物突變?yōu)辄c(diǎn)的特異性擴(kuò)增來(lái)判斷患者的患病情況，可利用其對(duì)α型SEA缺失、3.7缺失（右缺失）以及4.2缺失（左缺失）進(jìn)行鑒別。

同時(shí)可利用缺口性聚合鏈酶反應(yīng)技術(shù)，在診斷時(shí)需設(shè)計(jì)2或3對(duì)引物，在靠近基因缺失位點(diǎn)的外側(cè)設(shè)計(jì)1對(duì)引物，內(nèi)側(cè)設(shè)計(jì)1對(duì)或2對(duì)引物。其中在缺失位點(diǎn)內(nèi)側(cè)的引物能夠誘導(dǎo)缺失DNA或正常DNA擴(kuò)增出相應(yīng)片段，但前提是該診斷DNA內(nèi)純合子不能缺失，此時(shí)在缺失位點(diǎn)外側(cè)的1對(duì)引物就會(huì)使缺失的兩端不斷擴(kuò)增拉近，從而檢測(cè)出診斷DNA中的純合子情況。目前，我國(guó)臨床應(yīng)用該項(xiàng)技術(shù)能夠分辨出3種地中海貧血癥[7]。

熒光聚合鏈酶反應(yīng)技術(shù)的診斷敏感性更高，其是常規(guī)技術(shù)的1000倍左右，而且還可以利用不同的熒光素對(duì)體外擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行標(biāo)記，從而使診斷者更容易分辨正常的DNA片段、雜合子以及純合子。目前我國(guó)高等醫(yī)療機(jī)構(gòu)內(nèi)已經(jīng)配備了相關(guān)掃描儀器，主要針對(duì)常見(jiàn)的β型地中海貧血癥實(shí)驗(yàn)診斷，其操作更加簡(jiǎn)單，且對(duì)DNA提取量要求較高低，診斷時(shí)間更短，但相對(duì)應(yīng)的成本較高[8]。

3.4 反向點(diǎn)雜交診斷技術(shù)

該雜交技術(shù)的基本理念與探針點(diǎn)雜交相似，但反向點(diǎn)雜交技術(shù)是將固定的靶向DNA更換為固定的探針，可通過(guò)單一雜交分別診斷DNA上多個(gè)變異位點(diǎn)，提升了臨床診斷的效率。在診斷過(guò)程中以DNA末端的轉(zhuǎn)移酶為目標(biāo)，使其轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗑畚舶?，并將其固定在制定的生物膜上進(jìn)行序列擴(kuò)增雜交，雜交完成后可利用電泳法對(duì)基因片段進(jìn)行確定，包括不同類(lèi)型的純合子、雜合子等的診斷，目前廣泛地應(yīng)用在突變型β型地中海貧血癥、缺失型α型地中海貧血癥的診斷當(dāng)中。

3.5 基因芯片雜交診斷技術(shù)

隨著當(dāng)前國(guó)內(nèi)對(duì)地中海貧血癥研究的不斷深入，使得該類(lèi)疾病突變型患者的診斷技術(shù)得到了較大的發(fā)展，其中基因芯片技術(shù)的科技含量較高。該技術(shù)本身也屬于DNA雜交技術(shù)的一種，其以基因序列核苷酸的擴(kuò)增技術(shù)為實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，以熒光素標(biāo)記或引物檢測(cè)等為方式，判斷發(fā)生突變基因的情況。其中熒光標(biāo)記法中不同突變位點(diǎn)所表現(xiàn)出的熒光顏色深淺具有一定差異，因此可根據(jù)其標(biāo)記后顏色的變化來(lái)判斷貧血癥的具體類(lèi)型，這樣的診斷技術(shù)更加直接、快速、有效。同時(shí)，由于基因芯片本身的通量較高，使得多個(gè)待測(cè)DNA樣本可以在同一張芯片上進(jìn)行診斷，這樣有利于如我國(guó)這種人口數(shù)量較多的國(guó)家開(kāi)展地中海貧血癥的普查工作[9]。但也由于該項(xiàng)診斷的技術(shù)含量較高，基因芯片的成本居高不下，臨床診斷成本是普通人難以接受的，在我國(guó)目前也僅適用于地區(qū)人口疾病普查工作當(dāng)中，限制了該技術(shù)的應(yīng)用范圍。

3.6 Southern印記雜交

該技術(shù)是對(duì)檢查的DNA片段雜交情況進(jìn)行鑒別，即利用靶向DNA作為模板形成雜交DNA片段，并將其以電泳的方式進(jìn)行分離，再結(jié)合在固相支持物上利用探針進(jìn)行鑒別的技術(shù)。該技術(shù)與其它DNA雜交技術(shù)一樣，均能夠?qū)z測(cè)基因中存在的問(wèn)題進(jìn)行鑒別，但該技術(shù)主要應(yīng)用在基因缺失型地中海貧血癥，以α型缺失型病癥為主，目前已經(jīng)成為了該類(lèi)疾病實(shí)驗(yàn)室診斷中所的“金標(biāo)準(zhǔn)”[10]。

4 結(jié)語(yǔ)

隨著國(guó)際上醫(yī)療技術(shù)發(fā)展速度的加快，對(duì)于地中海貧血癥的實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)也在不斷提升，血液篩查和基因診斷方式層出不窮。但由于目前我國(guó)各地區(qū)貧富差距仍較為明顯，使得各基層醫(yī)院內(nèi)并沒(méi)有充足的條件來(lái)開(kāi)展產(chǎn)前檢查工作，使得地中海貧血癥的診斷率下降。而導(dǎo)致這一情況的原因在于檢查費(fèi)用過(guò)高、操作步驟繁瑣等，因此在未來(lái)地中海貧血癥實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)發(fā)展時(shí)，應(yīng)向著更加快捷、簡(jiǎn)便、低廉等方向。

（作者單位：廣西平南縣婦幼保健院檢驗(yàn)科）

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