文/山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 莊金秋 梅建國(guó) 李 峰 姚春陽(yáng) 馬 力

豬呼腸孤病毒的特征及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

文/山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 莊金秋 梅建國(guó) 李 峰 姚春陽(yáng) 馬 力

仔豬病毒性腹瀉一直是困擾養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要因素。豬呼腸孤病毒(Porcine reovirus，PRV)屬呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬成員，是仔豬病毒性腹瀉的主要原因之一。PRV在豬群中廣泛存在，對(duì)豬具有一定的致病性。另外，健康豬群體內(nèi)也會(huì)存在PRV。PRV感染未吃初乳的初生仔豬會(huì)引起豬的體溫升高以及腹瀉等癥狀。由于PRV感染豬的致病機(jī)制尚不明確，因此目前還沒(méi)有特異性的預(yù)防和治療該疾病的方法。本文概括了PRV的病毒特征及檢測(cè)技術(shù)，以期對(duì)疾病的預(yù)防和控制提供參考。

1 病毒的由來(lái)和發(fā)現(xiàn)

目前報(bào)道的豬呼腸孤病毒共有3個(gè)血清型，其中I型由Kasza等(1970)和McFerran等(1970)分別分離報(bào)道；Ⅲ型由Robl等(1971)分離報(bào)道；Ⅱ型由Fukutomi等(1996)在日本首次分離報(bào)道。曾志勇等(2006)在國(guó)內(nèi)首次從豬體內(nèi)分離得到了Ⅲ型哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒SC-A株，隨后，Zhang等(2007)也分離得到一株Ⅲ型的哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒MRV-HLJ/2007株，Kwon等(2011)從韓國(guó)78個(gè)豬場(chǎng)237份腹瀉樣品中檢出了45份Ⅲ型哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒陽(yáng)性(檢出率達(dá)19%)，并且從陽(yáng)性病料中分離得到10株Ⅲ型哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒。從患有呼吸道疾病或胃腸道疾病的豬、臨床健康的豬、流產(chǎn)胎兒等都可分離得到呼腸孤病毒。實(shí)驗(yàn)接種有時(shí)不會(huì)發(fā)病。

2 病毒的分類地位

豬呼腸孤病毒為呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬成員，為分節(jié)段的雙鏈RNA病毒。已知呼腸孤病毒科(Reoviriche)是一個(gè)龐大的病毒科，有9個(gè)既定屬和2個(gè)擬定屬，能廣泛地侵染自然界中各種生物有機(jī)體，并可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生各種病理反應(yīng)。其中，哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒(Mammalian Reovirus，MRV)，主要感染人和哺乳動(dòng)物（如豬、牛、馬、犬、貓、鼠等）的呼吸道或消化道，對(duì)動(dòng)物具有廣泛的致病性。豬呼腸孤病毒是MRV的一種，無(wú)囊膜，具有特征性的20面體對(duì)稱雙層衣殼結(jié)構(gòu)。完整的病毒粒子直徑為76nm左右，核心的直徑約52nm。

3 流行病學(xué)特點(diǎn)

呼腸孤病毒是一類既能感染呼吸道，又能感染胃腸道的病毒，豬群中流行普遍。幾乎所有的豬都可檢測(cè)到3種血清型的抗體。病毒經(jīng)口感染或經(jīng)呼吸道感染。被動(dòng)抗體在新生仔豬體內(nèi)可存在11周左右，之后任何年齡的豬對(duì)呼腸孤病毒均有易感性。

4 臨床癥狀

呼腸孤病毒在接種24h后由鼻腔分泌物和糞便排出，可持續(xù)6～14d。通常斷奶仔豬鼻內(nèi)接種或接觸由氣溶膠傳播的I型呼腸孤病毒，表現(xiàn)輕微的呼吸道癥狀，主要特征是發(fā)熱、打噴嚏、食欲不振、精神沉郁等。呼腸孤病毒Ⅲ型經(jīng)靜脈或肌肉注射血清呈陰性的，若40～85d的經(jīng)產(chǎn)母豬感染，可導(dǎo)致木乃伊胎、死胎、弱胎等?？蓮慕?jīng)產(chǎn)母豬的流產(chǎn)排泄物和胎盤中分離得到病毒。

5 病理變化

所有豬呼腸孤病毒的動(dòng)物試驗(yàn)均表明其不會(huì)導(dǎo)致受感染仔豬產(chǎn)生明顯的臨床癥狀，但可對(duì)肺臟或腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生輕微損傷。呼腸孤病毒接種的研究表明，感染后很少有全身性病理變化，一般只顯示輕微的顯微病理變化。I型呼腸孤病毒以氣溶膠的形式感染4周齡的SPF仔豬，不會(huì)導(dǎo)致全身性病理變化，但可引起一致的肺部顯微病變——淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在肺泡和肺泡間隔多灶性集聚，及支氣管淋巴細(xì)胞肥大性增生。70kg的SPF豬經(jīng)鼻內(nèi)接種呼吸道分離的Ⅲ型呼腸孤病毒，可導(dǎo)致肺泡性肺氣腫、支氣管結(jié)節(jié)狀淋巴細(xì)胞肥大性增生，各肺小葉之間程度不同。

6 病毒的致病機(jī)制

豬呼腸孤病毒在豬群中廣泛存在，對(duì)豬具有一定的致病性。豬呼腸孤病毒感染初生仔豬后，可能會(huì)引起仔豬的體溫瞬間升高、腹瀉，甚至是肺部的纖維化。而有些仔豬感染后，僅表現(xiàn)出亞臨床經(jīng)過(guò)，但還能從仔豬糞樣中再次檢測(cè)到病毒。呼腸孤病毒主要是在自然感染豬的呼吸道和腸道中復(fù)制。呼腸孤病毒的致病機(jī)理和病理變化目前主要是用小鼠來(lái)研究，所取得的進(jìn)展對(duì)于病毒及病毒與宿主間的作用很有意義。小鼠感染呼腸孤病毒后可引起心肌炎，這與呼腸孤病毒侵入后可引起無(wú)明顯炎癥反應(yīng)的心肌細(xì)胞損傷有關(guān)。盡管豬呼腸孤病毒是否造成仔豬腹瀉與諸多因素有關(guān)，但因其與人呼腸孤病毒同屬M(fèi)RV，不能排除人畜共患的可能，故需謹(jǐn)慎對(duì)待呼腸孤病毒，應(yīng)對(duì)呼腸孤病毒與動(dòng)物和人類疾病的關(guān)系等作進(jìn)一步研究。

7 病毒的檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

目前已知的豬呼腸孤病毒所致的臨床癥狀和病理變化都不具有特征性，因此，該病的診斷有賴于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

7.1 病毒分離與鑒定

雖然該病毒存在于病豬糞樣、呼吸道分泌物、肺、脾等組織中，但發(fā)病后8～12h內(nèi)的糞和呼吸道分泌物的檢出率最高，而糞便是樣品采集的首選。該病毒對(duì)多種細(xì)胞系以及多種原代細(xì)胞都能適應(yīng)，并產(chǎn)生細(xì)胞病變(CPE)。哺乳動(dòng)物的血清均可能含有抗呼腸孤病毒的抗體，分離前要除去。曾志勇等(2008)通過(guò)在病毒培養(yǎng)液中添加胰酶的方法，用Vero細(xì)胞進(jìn)行病原分離，結(jié)果分離到1株能在該細(xì)胞上穩(wěn)定產(chǎn)生明顯CPE，即以細(xì)胞顆粒增多、腫脹、漂落為特征的分節(jié)段的雙鏈RNA病毒，經(jīng)系列鑒定后證實(shí)為豬呼腸孤病毒，并命名為豬呼腸孤病毒SC-A株。何小明(2013)通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加胰酶的方法，從仔豬腹瀉糞樣中分離到豬源I型呼腸孤病毒SHR-A株。呼腸孤病毒可通過(guò)兩種途經(jīng)感染細(xì)胞：①通過(guò)病毒粒子吸附于細(xì)胞表面的受體分子，在受體介導(dǎo)的胞吞作用下侵入細(xì)胞，并借助溶酶體中一些蛋白酶降解其外衣殼，生成具有感染性的次病毒顆粒(ISVP)；②部分病毒粒子在胞外經(jīng)蛋白酶降解生成的ISVP后直接侵入細(xì)胞，此時(shí)則不依賴于受體介導(dǎo)的胞吞作用。可能正是因?yàn)樵诓《九囵B(yǎng)液中添加了胰蛋白酶，從而減少了病毒對(duì)細(xì)胞及其受體的依賴，并最終成功分離得到病毒株。

7.2 血清學(xué)方法

7.2.1 血凝抑制試驗(yàn)(HI) Ⅰ型和Ⅱ型豬呼腸孤病毒均有凝集人紅細(xì)胞的顯著特性，Ⅲ型呼腸孤病毒能凝集牛紅細(xì)胞，并比凝集人紅細(xì)胞的滴度高。這2種動(dòng)物的紅細(xì)胞是該病毒血凝試驗(yàn)的主要材料。另外，該病毒能凝集豬紅細(xì)胞，不能凝集豚鼠和雞紅細(xì)胞。該病毒的凝集作用可被同型血清有效抑制。因此，一般用血凝抑制試驗(yàn)鑒定其血清型別。

7.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 中國(guó)廣東分離株GD-1屬于血清Ⅲ型，該病毒含有10條分節(jié)段基因，其中編碼σ1蛋白的為Sl基因。研究表明，σ1蛋白是一種細(xì)胞的吸附蛋白，也是一種血凝素，雖然其僅占病毒顆粒的比重為2%，但它是引起特異性的抗病毒免疫反應(yīng)作用的關(guān)鍵蛋白，能夠介導(dǎo)病毒與細(xì)胞受體的結(jié)合，與特異性的血清型抗體相結(jié)合，因而可以應(yīng)用于抗體的檢測(cè)。劉啟亮等(2016)采用PCR方法擴(kuò)增PRV GD-1株S1基因，并以原核系統(tǒng)表達(dá)其編碼的σ1蛋白。以純化的σ1蛋白作為包被抗原，鵝抗豬IgG-HRP為檢測(cè)抗體，建立了PRV血清型Ⅲ型間接ELISA血清學(xué)的檢測(cè)方法。應(yīng)用該法和同類ELISA進(jìn)口抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)606份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，兩者符合率為96.2%。該方法的建立為進(jìn)一步開發(fā)商品化試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

7.3 分子生物學(xué)方法

PCR具有快速、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于PRV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。2011年底以來(lái)，我國(guó)很多省市初生仔豬出現(xiàn)腹瀉性疾病。病豬以腹瀉、脫水、厭食、迅速消瘦為主要特征。一些研究結(jié)果顯示，其主要病原包括豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、輪狀病毒和博卡病毒等。為了進(jìn)一步研究該類疾病的病原流行毒株特性，陳興慧等(2012)研究采用上述31個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)102份腹瀉病料樣品，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)PRV，結(jié)果REOV的豬場(chǎng)陽(yáng)性率為45.16%，病料樣品陽(yáng)性率為26.47%。選擇2份病料無(wú)菌處理后接種Vero細(xì)胞，維持液中添加5μg/mL胰酶，傳代2～3次，出現(xiàn)CPE，經(jīng)過(guò)RT-PCR擴(kuò)增和基因序列分析，病毒粒子負(fù)染電鏡觀察，證明其為PRV，命名為ZJ120101和AH120411毒株。談晨(2013)通過(guò)RT-PCR方法從仔豬腹瀉病料中檢測(cè)出PEDV和PRV，PEDV豬場(chǎng)陽(yáng)性率67.74%，病料樣品陽(yáng)性率46.08%，PRV的豬場(chǎng)陽(yáng)性率為45.16%，病料樣品陽(yáng)性率為26.47%，豐富了我國(guó)仔豬腹瀉病原流行病學(xué)資料。何小明(2013)用套式RT-PCR檢測(cè)2010年1月～2012年12月送檢的不同豬場(chǎng)病料，并對(duì)其中45份陽(yáng)性病料的核酸進(jìn)行濃縮后用根據(jù)S1基因設(shè)計(jì)的型特異性的引物進(jìn)行RT-PCR，同時(shí)將擴(kuò)增產(chǎn)物純化并克隆至T載體經(jīng)測(cè)序后進(jìn)行進(jìn)化分析。進(jìn)化分析結(jié)果表明這些毒株分屬血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅲ型毒株為優(yōu)勢(shì)流行毒株，流行范圍覆蓋大陸絕大部分地區(qū)。另外，其他分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，如熒光定量RT-PCR、核酸探針技術(shù)及核酸的PAGE電泳鑒定等也被相繼應(yīng)用于豬呼腸孤病毒的檢測(cè)。這些技術(shù)的應(yīng)用為新的檢測(cè)方法的建立、流行病學(xué)監(jiān)測(cè)以及有效的防控措施制定提供了理論基礎(chǔ)。■

略）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-08-17)；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2015GSF121027)。