陳少青， 王伊林， 曹憲玉， 張青山， 柴 花， 陶謝鑫， 趙 明

(內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院， 通遼 028000)

蒙藥新II號對擴張型心肌病大鼠心功能、心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及凋亡的作用*

陳少青， 王伊林， 曹憲玉， 張青山， 柴 花， 陶謝鑫， 趙 明△

(內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院， 通遼 028000)

目的：探討蒙藥新II號對阿霉素性擴張型心肌病大鼠心功能、心肌病理、心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及凋亡作用。方法：30 只SD 雄性大鼠分為3組(n=10)： 正常對照組、模型組(腹腔注射阿霉素2 mg/kg體重，1次/周，用藥4周后觀察4周)和蒙藥新II號組(腹腔注射阿霉素2 mg/kg體重，1次/周，用藥4周后，給予蒙藥新II號30 mg/kg·d灌胃，共4周)。觀察大鼠的一般情況，8 周后行高頻超聲心動圖檢查，測定各項心功能指標，檢查結(jié)束后處死大鼠，取心臟，行HE 染色、VG染色及電鏡觀察。用TUNEL 法檢測各組大鼠心肌細胞凋亡, Western blot 檢測各組大鼠心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78、GRP94及促凋亡因子CHOP、caspase-3表達。結(jié)果：與模型組相比較，①蒙藥新II號組大鼠心臟左室結(jié)構(gòu)及血流動力學各項指標均有明顯改善(P<0.05)。②蒙藥新II號組大鼠心肌病理積分明顯下降(P<0.01)。③蒙藥新II號組大鼠心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激伴侶蛋白GRP78、GRP94、CHOP、caspase-3表達及細胞凋亡明顯減少 (P<0.01)。結(jié)論：蒙藥新II號可改善擴張型心肌病大鼠心臟功能，減輕心肌病理變化，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，減少心肌細胞凋亡。這一實驗結(jié)果可能是蒙藥新II號治療擴張型心肌病作用機制之一。

蒙藥新II號； 擴張型心肌?。粌?nèi)質(zhì)網(wǎng)應激；凋亡；阿霉素；大鼠

擴張型心肌病為病因還不明確的一側(cè)或雙側(cè)心腔擴大，并且出現(xiàn)心肌肥厚、心肌收縮期的泵血功能性障礙[1]，進而發(fā)生充血性心力衰竭的一種心臟疾病。如果沒有得到有效治療，病情會呈進行性加重趨勢[2]，導致心肌收縮力急劇下降引起心力衰竭，可以導致患者死亡。目前擴張型心肌病合并心力衰竭尚缺乏特異性的治療方法，臨床病死率比較高。為此積極開展擴張型心肌病所致心力衰竭病因及治療研究，仍是目前和今后的一項艱巨任務。

蒙藥新II號是蒙醫(yī)傳統(tǒng)驗方，由廣棗、人工牛黃、白云香等17味蒙藥組成的復方，對“氣虛”所致的心悸、胸痹等癥，具有顯著的強心作用，在臨床上用于治療冠心病,擴張型心肌病多年，在治療冠心病、擴張型心肌病逆轉(zhuǎn)心室重塑方面有良好的療效[3]，但作用機制不明，有待深入研究價值。本研究通過觀察蒙藥新II號對擴張型心肌病模型大鼠心功能、心肌病理及超微結(jié)構(gòu)作用，初步明確蒙藥新II號治療擴張型心肌病逆轉(zhuǎn)心室重塑作用機制，為蒙藥的深層次應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠購置吉林大學基礎醫(yī)學院動物中心,許可證號：scxk(吉)2011-0004。阿霉素(深圳萬東藥業(yè)), anti-GRP78(Boster，中國)、anti-GRP94(Boster，中國)、anti-CHOP(Abcam，美國)、anti-caspase-3(Sigma，美國)，蒙藥新II號(主要成分：廣棗、阿魏、沉香、野牦牛心、肉豆蔻、丁香、藏紅花、白云香、牛黃等16味藥組成)(內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院蒙藥制劑室 批準文號：哲衛(wèi)準字9804-46)。光學顯微鏡(Olympus, 日本)和電子顯微鏡( H-600型，日本) 。

1.2 阿霉素造模擴張型心肌病大鼠模型制備及實驗分組

30 只SD 雄性大鼠體重200 g,適應性喂養(yǎng)后，隨機分為3組(n=10)：對照組、模型組和蒙藥新II號組(蒙藥新II號+阿霉素)。模型組大鼠腹腔注射阿霉素(2 mg/kg 體重，1次/周，用藥4 周后停藥觀察4 周)，蒙藥新II號組大鼠腹腔注射阿霉素(2 mg/kg 體重，1次/周，用藥4 周后，蒙藥新II號研成粉劑，溶于0.9%NaCl溶液中，根據(jù)人鼠使用劑量換算蒙藥新II號30 mg /kg，每日灌胃一次，共4 周)，對照組與模型組給予同等量0.9%NaCl溶液灌胃，觀察大鼠的一般情況。

1.3 高頻超聲心動圖的測定

于實驗第8 周結(jié)束, 對各組大鼠進行經(jīng)胸高頻超聲心動圖檢查。使用GE Vivid E9 彩色超顯像儀, 經(jīng)胸壁高頻超聲ML6-15 探頭, 頻率13 MHz, 圖像深度3.5 cm。10% 水合氯醛0.2 g/kg腹腔注射麻醉大鼠, 在二維超聲引導下,M 型超聲測定胸骨旁左心長軸切面左室腱索水平左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-systole，LVIDs) 及左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal diastolic diameter，LVIDd),Teichholtz 公式法計算左室短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S), 每一測定值均取3 個連續(xù)完整心動周期測量的平均值。

1.4 血流動力學指標的監(jiān)測

各組大鼠行高頻超聲心動圖檢查后,將大鼠用3% 戊巴比妥鈉15 mg/kg麻醉后仰臥位固定于手術(shù)臺上,于頸部正中取切口, 然后鈍性分離右側(cè)頸總動脈, 結(jié)扎遠心端, 牽拉阻斷近心端, 用30 G注射針頭在遠心端穿刺動脈, 插入右頸總動脈、升主動脈, 逆行插入左心室內(nèi),通過1.4 F 微導管經(jīng)壓力換能器連接BL-420多道生理記錄儀測量各組小鼠左心室壓(left ventricular pressure, LVP)及左心室內(nèi)壓最大變速率(dp/dt)變化, 以反映心肌收縮力。

1.5 病理取材及切片制作

行高頻超聲心動圖及血流動力學檢查后，處死大鼠，暴露心臟并取出，將上1/3 心臟組織行固定、脫水、石蠟包埋、切片等實驗步驟，然后取出心肌切片，脫蠟、二甲苯透明、HE 常規(guī)染色及VG染色，光鏡下觀察病理后對圖片進行掃描，用Image J圖像分析軟件對VG 染色圖片進行心肌組織膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction，CVF)分析，CVF = 膠原面積/總面積。同時將中、下1/3 心臟組織加于2.5% 戊二醛溶液中固定，PBS 溶液漂洗，1% 鋨酸固定，再用PBS 溶液漂洗，梯度乙醇脫水，Epon812 環(huán)氧樹脂浸透包埋，超薄切片成70 nm的切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，透射電鏡下觀察拍片存檔。

1.6 TUNEL檢測心肌細胞凋亡

處死各組大鼠后，在無菌狀態(tài)下暴露心臟，取1/3心臟組織經(jīng)過下列步驟(1) 滴加0.1 % Triton×100(0.1 %檸檬酸鈉鹽配置) 50 μl，室溫放置8 min。(2)PBS漂洗，3×5 min。(3) 滴加3% H2O2以覆蓋爬片，室溫放置10 min。(4) 配制TUNEL reaction mixture：Enzyme solution與Label Solution按1∶9配制(即用即配，冰上操作)。(5)滴加TUNEL反應液至完全覆蓋玻片。(6)保濕、避光、37℃孵育60 min。(7)滴加Converter-POD 50 μl。(7) 加DAB底物直至完全覆蓋玻片，待顏色剛剛變深時迅速置于水中終止反應。 (8) 滴加蘇木素，復染3 min后，用蒸餾水清洗，滴加1%鹽酸乙醇中分化3 s，立即用自來水清洗，流水反藍20 min。(9) 滴加甘油乙醇封片。(10)顯微鏡下觀察染色效果，400×鏡下拍照。隨機移動組織切片，選取細胞分布較均勻的高倍視野計數(shù)1 000個以上，選擇相鄰的10個視野，紅色細胞即為陽性細胞。運用下列公式計算細胞凋亡指數(shù)：凋亡指數(shù)(AI)=各視野陽性細胞數(shù)/視野所有細胞總數(shù)×100%

1.7 Western blot檢測GRP78、GRP94、CHOP、caspase-3表達

應用抗體：anti-GRP78(1∶500)、anti-GRP94(1∶500)、anti-CHOP(1∶1 000)、anti-caspase-3(1∶1 000)。各組乳鼠心肌細胞經(jīng)下列實驗步驟: (1)蛋白質(zhì)抽提; (2)采用BCA法進行蛋白質(zhì)定量; (3)取15 μl的樣品進行SDS-PAGE; (4) 轉(zhuǎn)印至PVDF膜;(5) 封閉; (6) 孵育一抗; (7) 孵育二抗; (8)ECL底物發(fā)光; (9) 圖像保存。普通抗體的封閉液、一抗孵育液、二抗孵育液為 5%脫脂奶粉溶液。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠高頻心臟超聲測定結(jié)果

與對照組相比,模型組大鼠LVEDd 及LVEDs 明顯增加(P<0.01),FS 及EF值降低(P<0.01), 提示模型組大鼠心腔擴大, 收縮功能下降符合擴張型心肌病心臟彩超改變。與模型組大鼠相比, 蒙藥新II號組大鼠LVEDd 及LVEDs 減少(P<0.01)，F(xiàn)S 及EF值增加(P<0.01，表1)。

2.2 血流動力學指標的監(jiān)測

對照組、模型組與蒙藥新II號組大鼠心臟的血流動力學參數(shù)指標變化情況見表2,可見模型組大鼠心肌收縮力指標LVP 和dp/dt明顯低于對照組(P<0.01)，與模型組大鼠比較，蒙藥新II號組大鼠血流動力學指標有明顯改善(P<0.05)。

Tab. 1 Changes of high frequency echocardiography of rats heart in each group(±s,n=10)

GroupLVIDd(mm)LVIDs(mm)FS%EF%A4．77±0．532．43±0．3448±488±4B6．70±0．47??3．74±0．44??34±2??65±10??C5．21±0．49??##2．69±0．32##45±4##78±7??##

A： Control group; B: Model group; C: Mongolian new medicine-II group； LVIDd: Left ventricular internal diastolic diameter; LVIDs: Left ventricular internal diameter at end-systole; FS: Fractional shortening; EF: Ejection fractions

**P<0.01vscontrol group；?##P<0.01vsmodel group

Tab. 2 Changes in cardiac hemodynamic parameters in rat(±s,n=10)

GroupLVP(P/kPa)+dp/dt(kPa/s)?dp/dt(kPa/s)A15．7±3．5323±39?263±31B9．9±1．6??263±29???197±26??C11．5±1．1?#298±33?#?231±31?#

A: Control group; B: Model group; C: Mongolian new medicine-II group; LVP: Left ventricular pressure

**P<0.01vscontrol group；?#P<0.05vsmodel group

2.3 病理學改變

2.3.1 光鏡觀察HE染色結(jié)果 光鏡HE 染色結(jié)果：對照組大鼠心肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，細胞質(zhì)豐富均勻，細胞核呈圓形或橢圓形，位于細胞中央，核仁清晰，未見心肌纖維變性壞死等病理性改變。模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，細胞核固縮變性，核仁消失，間質(zhì)明顯水腫，可見大量淋巴細胞浸潤。蒙藥新II號組大鼠大部分心肌纖維排列整齊，少數(shù)心肌纖維排列紊亂，少數(shù)心肌細胞細胞核固縮變性，核仁消失，心肌纖維間質(zhì)可見少許水腫，可見少量淋巴細胞浸潤(圖1，見彩圖頁Ⅲ)。

2.3.2 光鏡觀察VG染色及膠原容積分數(shù)檢測結(jié)果 VG染色結(jié)果中膠原纖維呈紅色，細胞質(zhì)、肌纖維呈黃色。對照組大鼠只見少許纖維組織，模型組大鼠可見大量纖維組織，心肌纖維化嚴重。蒙藥新II號組大鼠與模型組比較，心肌纖維化明顯減輕。模型組CVF為(12.3±0.72)%, 較正常對照組(2.7±0.29)%顯著增加, 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而蒙藥新II號組CVF為(6.1±1.7)%, 較模型組(12.3±0.72)%顯著降低, 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖2，見彩圖頁Ⅲ)。

2.3.3 電鏡觀察結(jié)果 對照組心肌細胞核膜完整, 細胞核呈橢圓形, 染色質(zhì)分布均勻, 心肌纖維排列整齊, 明暗帶清楚, 細胞內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)正常, T管結(jié)構(gòu)正常,肌漿網(wǎng)無擴張。模型組可見心肌纖維溶解破壞、片狀消失, 部分心肌細胞核膜消失、不完整, 胞漿濃縮, 細胞膜腫脹、斷裂或鋸齒樣突起, 線粒體極度腫脹,呈空泡樣變, T 管、肌漿網(wǎng)擴張明顯, 肌絲疏松。與模型組比較，蒙藥新II號組大鼠線粒體腫脹明顯減輕, T 管、肌漿網(wǎng)擴張減輕(圖3)。

Fig. 3 Transmisson electron microscopy images of hearts in each group(Original magnification×1 500) A: Control group; B: Model group; C: Mongolian new medicine-II group

2.4 TUNEL檢測心肌細胞凋亡結(jié)果

用TUNEL 法檢測對照組大鼠僅有少量凋亡的細胞(AI=3.94±2.14)，與對照組相比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡明顯, AI 為19.14±6.1 (P<0.01),與模型組大鼠相比較，蒙藥新II號組大鼠心肌細胞AI 為8.23±4.02凋亡細胞量明顯減少(P<0.01，圖4，見彩圖頁Ⅲ)。

2.5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激伴侶蛋白GRP78、GRP94、促凋亡因子chop、caspase-3表達

與對照組相比較，模型組大鼠心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激伴侶蛋白GRP78、GRP94、促凋亡因子CHOP、caspase-3表達顯著增多(P<0.01)；與模型組大鼠相比較，蒙藥新II號組大鼠心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激伴侶蛋白GRP78、GRP94、促凋亡因子CHOP、caspase-3表達顯著降低 (P<0.01，圖5，表3)。

Fig. 5 Western blot analysis and expression of GRP78, GRP94, CHOP and caspase-3 in myocardial cells of rats in each group A: Control group; B: Model group; C: Mongolian new medicine-II group

Tab. 3 The relative expression of GRP78,GRP94,CHOP and caspase-3 in myocardial cells of rats in each group(±s,n=10)

GroupGRP78GRP94CHOPCaspase?3A1．00±0．091．00±0．081．00±0．061．00±0．14B3．47±0．22??1．84±0．12??3．74±0．33??4．34±0．28??C2．23±0．18##1．07±0．11##1．97±0．13##1．05±0．09##

A: Control group; B: Model group; C: Mongolian new medicine-II group

**P<0.01vscontrol group；?##P<0.01vsmodel group

3 討論

擴張型心肌病因為病因及發(fā)病機制尚未明確，目前只能針對心力衰竭治療。文獻報道衰竭心臟中存在心肌細胞凋亡, 凋亡使工作心肌細胞絕對數(shù)量減少, 而導致心肌收縮力下降[4]。黃海華等研究發(fā)現(xiàn)，蜂膠總黃酮對阿霉素誘導的大鼠慢性心力衰竭心肌細胞凋亡具有抑制功能，并可明顯改善心衰大鼠心功能[5]。實驗研究、臨床實驗均表明細胞凋亡干預是防治心力衰竭的一條有效的全新途徑[6,7]。凋亡的產(chǎn)生機制復雜,文獻報道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應介導的細胞凋亡是一條新的細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導通路[8]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在心肌等肌細胞內(nèi)稱肌漿網(wǎng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是跨膜蛋白及分泌蛋白合成所在的細胞器。蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)一級結(jié)構(gòu)折疊成成熟的3、4級結(jié)構(gòu)后，分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正確折疊蛋白質(zhì)功能異常，可致誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)異常聚集，同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激性蛋白分泌增加，識別錯誤折疊蛋白，并通過蛋白酶體將其降解，上述一系列反應過程即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應(endoplasmic reticulum stress，ERS)。ERS發(fā)生后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過上調(diào)分子伴侶蛋白GRP78及GRP94 表達、抑制蛋白質(zhì)合成、加速錯誤折疊和未折疊蛋白質(zhì)降解等方式緩解ERS。然而持續(xù)或較嚴重的ERS 則觸發(fā)凋亡信號，誘導CHOP、caspase-3等促凋亡因子的表達及活化，引起細胞凋亡[9,10]。

擴張型心肌病中醫(yī)病機為“心陽不振，血脈瘀阻；水飲內(nèi)停，本虛標實”之證?？蓪⑵錃w屬為中醫(yī)“心悸、怔忡、水腫、痰飲”等病范疇。蒙藥新Ⅱ號中的野牦牛心(蒙藥稱寶哈-古熱森-珠日和)主治心律不齊、心絞痛；麝香與藏紅花配伍，可起到“活血破血，化瘀通痛痛，納氣平喘”之功效，相互協(xié)同，以增強藥效[11]。此外，現(xiàn)代藥理學證實，牛黃能明顯增強離體蛙心、豚鼠心臟及貓心乳頭肌的心肌收縮力[12]。上述藥物配伍后，理論上可有效改善擴張型心肌病患者心臟射血分數(shù)降低、體循環(huán)淤血等癥狀，但還需更多的藥理學實驗和臨床應用數(shù)據(jù)在下一步實驗中加以證實。

本實驗通過心臟超聲觀察到蒙藥新II號可以使擴張型心肌病大鼠 LVIDd、LVIDs、 FS%、EF%各項指標明顯改善。并且通過有創(chuàng)血流動力學指標監(jiān)測發(fā)現(xiàn)蒙藥新II號使擴張型心肌病大鼠心肌收縮力指標LVP 和dp/dt數(shù)值得到改善。同時發(fā)現(xiàn)蒙藥新II號可以使擴張型心肌病組大鼠心肌纖維排列紊亂得到明顯改善，變性、壞死心肌細胞減少，心肌細胞間質(zhì)水腫減輕，間質(zhì)纖維化明顯減少，并且蒙藥新II號使擴張型心肌病大鼠線粒體腫脹減輕, T 管、肌漿網(wǎng)擴張減輕，心肌細胞凋亡明顯減少，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激伴侶蛋白表達，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，引起促凋亡因子CHOP、caspase-3表達減少。上述實驗結(jié)果只能部分解釋蒙藥新II號逆轉(zhuǎn)心室重塑，改善擴張型心肌病患者心臟功能的作用機制，至于蒙藥新II號是如何抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡信號通路使心肌細胞凋亡減少，則有待后續(xù)實驗加以闡明。

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Effects of Mongolian new medicine-II on cardiac functions, endoplasmic reticulum stress and apoptosis in congestive heart failure rats with dilated cardiomyopathy

CHEN Shao-qing, WANG Yi-lin, CAO Xian-yu, ZHANG Qing-shan, CHAI Hua, TAO Xie-xin, ZHAO Ming△

(The Inner-Mongolia National University Affiliated Hospital, Tongliao 028000, China)

Objective: To investigate the effects of Mongolian new medicine-II on cardiac functions, myocardial pathology, endoplasmic reticulum stress and myocardial apoptosis in congestive heart failure with dilated cardiomyopathy in rats. Methods: Thirty SD male rats were randomly divided into 3 groups(n=10): control group, dilated cardiomyopathy group (intraperitoneal injection of adriamycin 2 mg/kg body weight, 1 time/week, 4 weeks after treatment were observed for 4 weeks), Mongolian new medicine-II group(intraperitoneal injection of adriamycin 2 mg/kg body weight, 1 time/week, 4 weeks after treatment, 30 mg/(kg·d) was given Mongolian new medicine-II orally for 4 weeks). During the experiment, general conditions of rats were observed. After 8 weeks, these rats were killed after measurement of the cardiac function indexes by high frequency echocardiography. The morphological changes of myocardial tissues were observed by using HE staining, VG staining and electron microscopic. The myocardial apoptosis was detected by TUNEL method and the expressions of endoplasmic reticulum chaperone GRP78, GRP94, pro-apoptotic factor CHOP and caspase-3 were monitored by Western blot. Results: ① Compared with dilated cardiomyopathy group, the cardiac systolic and diastolic functions were significantly increased in Mongolian new medicine-II group, which were reflected in that left ventricular contraction diameter(LVIDs) and left ventricular end-diastolic diameter(LVIDd) were decreased, and left ventricular shortening fraction(FS) and ejection fraction(EF) were increased. The hemodynamic parameters of rats were improved significantly in Mongolian new medicine-II group. ②Compared with dilated cardiomyopathy group, the myocardial lesion score was decreased and fibrosis of tissue space was relieved in Mongolian new medicine-II group. ③Compared with dilated cardiomyopathy group, the apoptosis of myocardial cells was decreased. ④The expressions of endoplasmic reticulum chaperone GRP78, GRP94, pro-apoptotic factor chop and caspase-3 were decreased in Mongolian new medicine-II group. Conclusion: Mongolian new medicine-II could improve the pathologic alterations of cardiac cells and cardiac functions, decrease endoplasmic reticulum stress, the degree of fibrosis and myocardial apoptosis. The experimental results may be one of the mechanisms of treatment function of Mongolian new medicine-II on dilated cardiomyopathy.

Mongolian new medicine-II; dilated cardiomyopathy; endoplasmic reticulum stress; apoptosis; adriamycin; rat

內(nèi)蒙古自然科學基金資助課題(2016MS08125)

2015-08-03

2016-05-17

R331.3；R-332

A

1000-6834(2016)05-419-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.05.009

△【通訊作者】Tel: 13474859991; E-mail: langzhe73@163.com