范風(fēng)云， 沈婉婷， 鄭青青， 高 媛， 胡凱媛， 范小芳， 毛孫忠， 龔永生

(溫州醫(yī)科大學(xué)低氧醫(yī)學(xué)研究所， 浙江 溫州 325035)

低氧性肺動(dòng)脈高壓小鼠體內(nèi)脂質(zhì)水平的變化*

范風(fēng)云， 沈婉婷， 鄭青青， 高 媛， 胡凱媛， 范小芳， 毛孫忠， 龔永生Δ

(溫州醫(yī)科大學(xué)低氧醫(yī)學(xué)研究所， 浙江 溫州 325035)

目的：觀察低氧性肺動(dòng)脈高壓小鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝的變化，探討脂質(zhì)代謝異常在低氧性肺動(dòng)脈高壓發(fā)生發(fā)展中的意義。方法：SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠20只，隨機(jī)分為2組(n=10)：常氧組和低氧組。常壓連續(xù)低氧3周(9%～11% O2，23 h/d)復(fù)制慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓模型，測(cè)定小鼠右心室壓(RVSP)和右心室與左心室加室間隔重量比[RV/(LV+S)]，Elisa法檢測(cè)血漿中總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)的含量；real-time PCR法檢測(cè)肝組織中3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCR)、低密度脂蛋白受體(LDLR)、清道夫受體B1(SR-B1)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合因子2(SREBF2)等基因的表達(dá)。結(jié)果：低氧組小鼠RVSP、RV/(LV+S)顯著高于常氧組(P<0.05)，血漿中HDL含量及HDL/LDL比值較常氧組顯著降低(P<0.05)，肝組織中LDLR、SR-B1基因表達(dá)較常氧組顯著下調(diào)(P<0.05)；RVSP與HDL/LDL比值及LDLR、SR-B1基因表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論：脂質(zhì)代謝異常參與小鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓的形成。

脂質(zhì)代謝；肺動(dòng)脈高壓；低氧；小鼠

近年來，脂質(zhì)代謝異常在肺動(dòng)脈高壓和肺血管重塑進(jìn)程中的作用倍受關(guān)注。研究表明：低氧或高脂膳食更容易誘發(fā)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因如載脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)[1]、脂聯(lián)素(adiponectin，APN)[2]、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor gamma，PPARγ)[3]等基因敲除小鼠肺血管重塑和肺動(dòng)脈高壓的形成，而應(yīng)用APN[4]、PPARγ激動(dòng)劑[5]可降低肺動(dòng)脈高壓和改善肺血管重塑，提示脂質(zhì)代謝異常參與肺動(dòng)脈高壓的形成。但脂質(zhì)代謝相關(guān)基因敲除小鼠本身就已存在脂質(zhì)代謝異常，高脂膳食喂養(yǎng)亦可導(dǎo)致小鼠脂質(zhì)代謝異常，有關(guān)單純低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓形成中是否存在脂質(zhì)代謝異常的問題尚未明了。

本實(shí)驗(yàn)復(fù)制小鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓模型，觀察其血漿脂質(zhì)含量及肝組織脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的變化，旨在探討低氧性肺動(dòng)脈高壓的形成中脂質(zhì)代謝的變化及可能的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，體重20～25 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(滬2007-0005)。小鼠血漿總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)等Elisa試劑盒購(gòu)自美國(guó)Phoenix Pharm Inc.；Quantscript RT Kit和Real Master Mix (Probe)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 動(dòng)物模型的制備

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠20只，隨機(jī)分為2組(n=10)：常氧組和低氧組。將低氧組小鼠置于常壓低氧艙內(nèi)(9%～11% O2，23 h/d)，連續(xù)3周，常規(guī)飼料喂養(yǎng)；常氧組置于艙外，自由呼吸空氣，其它飼養(yǎng)條件與低氧組相同。

1.3 動(dòng)物處理與標(biāo)本留取

動(dòng)物飼養(yǎng)3周后，用異氟烷吸入麻醉，右心導(dǎo)管法經(jīng)右側(cè)頸外靜脈插管至右心室，經(jīng)PowerLab生理信號(hào)處理系統(tǒng)(AD Instruments Inc.，Australia)記錄右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure，RVSP)，RVSP可間接反映小鼠肺動(dòng)脈壓。然后，經(jīng)腹動(dòng)脈取血，裝入預(yù)冷含肝素試管內(nèi)，離心后取上清，-70℃保存待測(cè)血脂含量。

放血處死動(dòng)物立即取出心肺，分別稱取右心室(right ventricle，RV)和左心室加室間隔(left ventricle plus septum，LV+S)的重量，并計(jì)算出RV/(LV+S)的重量比作為反映右室肥大的指標(biāo)。每組取6只小鼠的右肝組織約100 mg，用于提取總RNA，待測(cè)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平。

1.4 血漿TC、LDL、HDL含量檢測(cè)(Elisa法)

血漿TC、LDL、HDL含量通過Elisa試劑盒檢測(cè)，步驟完全按照試劑盒說明書操作。

1.5 肝組織脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平檢測(cè)(real-time PCR法)

Trizol一步法提取肝組織中總RNA，Quant Reverse Transcriptase一步法逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，TaqMan探針法行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，TaqMan探針由ABI公司提供。以10倍稀釋模板梯度樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，目標(biāo)基因與內(nèi)參照基因擴(kuò)增效率接近100%情況下，以內(nèi)參照基因β-actin基因作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相對(duì)定量，結(jié)果采用ΔΔCT法分析，計(jì)算低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)，3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶(HMG-CoA reductase，HMGCR)、清道夫受體B1(scavenger receptor class B1，SR-B1)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合因子2(sterol regulatory element-binding factor-2，SREBF2)等基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 低氧性肺動(dòng)脈高壓小鼠RVSP和RV/(LV+S)的變化

低氧小鼠組RVSP與RV/(LV+S)分別較常氧組高69.8%和50.7%(P<0.05，表1)，提示低氧性肺動(dòng)脈高壓小鼠復(fù)制成功。

GroupRVSP(mmHg)RV/(LV+S)Normoxia23．2±8．40．229±0．052Hypoxia39．4±9．9?0．345±0．066?

RVSP: Right ventricular systolic pressure; RV/(LV+S): The weight ratio of right ventricle (RV) to left ventricle plus septum (LV+S)

*P<0.05vsnormoxia

2.2 低氧性肺動(dòng)脈高壓小鼠血脂含量的變化

低氧組小鼠血漿中TC、LDL含量與常氧組之間無顯著差異(P>0.05)；低氧組小鼠HDL含量、HDL/LDL比值較常氧組分別低17%和38%(P<0.05，表2)。

Tab. 2 Comparison of the concentrations of lipids in mice plasma between the two groups(±s，n=10)

GroupTC(mmol/L)LDL(mg/dl)HDL(mg/dl)HDL/LDLNormoxia2．20±0．4741．52±6．8131．24±3．750．83±0．21Hypoxia2．23±0．2148．45±5．6525．98±1．74?0．51±0．13?

TC: Total cholesterol; LDL: Low density lipoprotein; HDL: High density lipoprotein

*P<0.05vsnormoxia

2.3 低氧性肺動(dòng)脈高壓小鼠肝組織脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的變化

低氧組小鼠肝組織中HMGCR、SREBF2基因表達(dá)與常氧組無顯著性差異(P>0.05)；與常氧組比較，低氧組小鼠肝組織中LDLR、SR-B1基因表達(dá)分別下調(diào)41%、53%(P<0.05，表3)。

GroupHMGCRLDLRSR?B1SRBEF2Normoxia0．934±0．2581．064±0．3970．916±0．2470．893±0．208Hypoxia0．861±0．1960．623±0．199?0．429±0．072?0．774±0．144

HMGCR: HMG-CoA reductase; LDLR: Low density lipoprotein receptor; SR-B1: Scavenger receptor class B1; SREBF2: Sterol regulatory element-binding factor-2

*P<0.05vsnormoxia

2.4 相關(guān)性分析

RVSP與血漿中HDL/LDL比值以及肝組織中HMGCR，LDLR，SR-B1，SREBF2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析表明：RVSP與HDL/LDL(r=-0.627，P=0.026)及LDLR(r=-0.757，P=0.006)、SR-B1(r=-0.934，P=0.001)基因表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05，圖1)，而與HMGCR(r=-0.32，P=0.168)、SREBF2(r=-0.38，P=0.122)基因表達(dá)無顯著相關(guān)性。

Fig. 1 Correlation analysis of RVSP and HDL/LDL, LDLR and SR-B1 between the two groups

3 討論

臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：肥胖、高脂血癥、胰島素抵抗與肺動(dòng)脈高壓、肺血管重塑的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6,7]。目前常在基因敲除小鼠水平探討脂質(zhì)代謝異常與肺動(dòng)脈高壓發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，APN、PPARγ、apoE是常見的脂質(zhì)代謝相關(guān)基因，研究發(fā)現(xiàn)APN或PPARγ基因敲除小鼠更容易誘發(fā)肺血管重塑、肺動(dòng)脈高壓，而外源性APN可以直接抑制肺血管平滑肌細(xì)胞增殖，在低氧和炎癥誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓中具有抗炎和抗血管重塑的作用[4]，PPARγ激動(dòng)劑可降低肺動(dòng)脈高壓和改善肺血管重塑等作用[5]；另外，Allan Lawrie等人用高脂膳食喂養(yǎng)apoE基因敲除小鼠發(fā)現(xiàn)該小鼠右心室收縮壓顯著增高、肺血管重塑明顯[1]，這些都提示脂質(zhì)代謝異常參與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展。但脂質(zhì)代謝相關(guān)基因敲除小鼠本身就存在脂質(zhì)代謝異常，高脂膳食本身亦可導(dǎo)致小鼠脂質(zhì)代謝異常，并不能真實(shí)反映脂質(zhì)代謝異常在低氧性肺動(dòng)脈高壓形成中的作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：低氧小鼠組RVSP與RV/(LV+S)較常氧組顯著升高，提示低氧性肺動(dòng)脈高壓小鼠復(fù)制成功[8]。HDL被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)因素，血漿中HDL的含量與冠心病的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，因?yàn)镠DL具有逆轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇、抗氧化、促纖溶、抗血栓等作用[9,10]。提示低氧性肺動(dòng)脈高壓小鼠血漿中脂質(zhì)含量發(fā)生變化，HDL/LDL比值下調(diào)可能是引發(fā)低氧性肺動(dòng)脈的因素之一。

血漿膽固醇的來源途徑主要有兩種：一是從食物中吸收的外源性膽固醇；另一種是肝臟中合成的內(nèi)源性膽固醇。HMGCR是體內(nèi)催化膽固醇內(nèi)源性合成的關(guān)鍵酶，是一些抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物治療靶點(diǎn)[11]。SRECF2是一類核轉(zhuǎn)錄因子，主要參與調(diào)節(jié)HMGCR等基因的轉(zhuǎn)錄[12]，在膽固醇的合成途徑中發(fā)揮重要作用。LDLR為一種膜鑲嵌式蛋白質(zhì)，該受體介導(dǎo)和調(diào)控LDL的胞吞作用，是攝取和清除LDL的關(guān)鍵受體，上調(diào)LDLR基因表達(dá)，可使血中LDL水平降低[13]。SR-B1是高密度脂蛋白受體，在肝臟中表達(dá)豐富，SR-B1介導(dǎo)HDL的膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)，并且具有清除氧化型LDL(ox-LDL)的作用[14]。

低氧組SR-B1、LDLR基因表達(dá)下調(diào)，提示膽固醇的清除減少，預(yù)示低氧肺動(dòng)脈高壓小鼠血漿LDL含量應(yīng)該是上升的，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻顯示：低氧組小鼠血漿LDL含量與常氧組相比雖然有少量升高但無顯著性差異，這或許與低氧妨礙LDL的形成[15]，或低氧誘導(dǎo)LDL氧化修飾為ox-LDL增加而LDL本身含量無明顯變化[16]等因素有關(guān)。有關(guān)低氧對(duì)機(jī)體內(nèi)LDL的形成、LDLR介導(dǎo)的膽固醇攝取與清除的影響及意義值得進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，在低氧性肺動(dòng)脈高壓形成中小鼠體內(nèi)脂質(zhì)含量水平及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)水平發(fā)生變化，提示脂質(zhì)代謝異?？赡軈⑴c小鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓的形成。

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Changes of lipid levels in mice with hypoxic pulmonary arterial hypertension

FAN Feng-yun, SHEN Wan-ting, ZHENG Qing-qing， GAO Yuan, HU Kai-yuan, FAN Xiao-fang, MAO Sun-zhong， GONG Yong-shengΔ

(Institute of Hypoxia Medicine, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China)

Objective: To observe the changes of lipid levels in mice with pulmonary hypertension induced by hypoxia. Methods: The animal model of hypoxic pulmonary hypertension was established by exposing the mice to isobaric hypoxic chamber for 3 weeks (23 h/d, regular chow feed). Twenty male C57BL/6 mice were randomly divided into normoxia group and hypoxia group (n=10). The concentrations of total cholesterol, low density lipoprotein (LDL)and high density lipoprotein (HDL) in plasma were detected by Elisa method.The mRNA levels of HMG-CoA reductase (HMGCR), low density lipoprotein receptor (LDLR), scavenger receptor class B1 (SR-B1), and sterol regulatory element-binding factor-2 (SREBF2) in liver were measured by real-time PCR. Results: ① The right ventricular systolic pressure (RVSP) and the weight ratio of right ventricle (RV) to left ventricle plus septum (LV+S) of hypoxia group were significantly higher than those of normoxia group (P<0.05).② The concentrations of HDL and HDL/LDL in plasma were significantly higher in hypoxia group, compared with normoxia group (P<0.05).③The mRNA levels of LDLR and SR-B1in liver were significantly down-regulated in hypoxia group (P<0.05).④RVSP were significantly negative correlated with HDL/LDL, the gene expression of LDLR and SR-B1 (P<0.05). Conclusion: Abnormal lipid metabolism participates in the pathological proceeding of pulmonary hypertension induced by hypoxia.

lipid metabolism; pulmonary hypertension; hypoxia; mice

浙江省自然基金(LY14H010005)；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2014R413029)

2015-06-23

2016-05-12

R363.2

A

1000-6834(2016)05-463-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.05.020

△【通訊作者】Tel: 0577-86699521; E-mail: fxbwzmc@126.com