馬方圓，王春賀，李佳芮，金洋，黃幫蕊，郭，金向群

(吉林大學(xué)藥學(xué)院，長春130021)

抗氧化軟膠囊具有清除體內(nèi)自由基、抗氧化的作用，其主要成分為三七、丹參、川芎。三七作為傳統(tǒng)的珍貴中草藥[1]，功效顯著，可散淤止血、消腫止痛，用于治療多種出血性疾病，對機(jī)體的抗自由基起到了相當(dāng)大的輔助作用，可以有效抵抗自由基對機(jī)體的損害，預(yù)防常見疾病的產(chǎn)生與惡化；丹參是較為常見的中草藥，是唇形科植物丹參的干燥根和根莖，具有活血調(diào)經(jīng)、涼血消癰、養(yǎng)血安神等功效，對超氧陰離子具有清除的能力。為了對抗氧化軟膠囊進(jìn)行質(zhì)量控制，本研究使用反向高效液相色譜法建立抗氧化軟膠囊中有效成分的含量測定方法[2，3]。

1　儀器與試劑

1.1　儀器

Waters2489液相色譜儀、AB204-N分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ-250D數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；JT2001電子天平(上海精天電子儀器有限公司)；水浴鍋(鞏義市英峪予華儀器廠)；色譜填充柱：AgilentTC-C18(2)(4.6mm×250mm，5μm)(美國安捷倫科技有限公司)。

1.2　試劑

抗氧化軟膠囊(吉林大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室自制)；三七皂苷R1(批號：15090815，含量：98.67%)、人參皂苷Rg1(批號：15042215，含量：98.1%)、丹酚酸B(批號：15051708，含量：99.02%)(北京恒元啟天化工技術(shù)研究院)；乙腈、磷酸、甲醇(色譜級，F(xiàn)isher Scientific公司)；水為三蒸水。

2　方法與結(jié)果

2.1　薄層檢測

取本品1粒，剪開，將內(nèi)容物置于小燒杯中，用10mL環(huán)己烷將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用甲醇萃取2次，每次10mL，合并上層液，蒸干用10mL甲醇溶解，作為供試品溶液。另取丹參酮IIA標(biāo)準(zhǔn)品，制成1mg/mL的溶液，作為對照品溶液。按照2015版中華人民共和國藥典(以下簡稱藥典)附錄VIB薄層色譜法操作，吸取上述2種溶液各6μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以V石油醚(30℃～60℃)-V乙酸乙酯(4∶1)作為展開劑，展開，取出，晾干。結(jié)果在與標(biāo)準(zhǔn)品色譜相應(yīng)位置顯示相同暗紅色斑點(diǎn)(圖1)。

2.2　含量測定

2.2.1對照品溶液的制備精密稱定經(jīng)過P2O5干燥24h的三七皂苷R11.2mg、人參皂苷Rg12.3mg和丹酚酸B 1.5mg的標(biāo)準(zhǔn)品，于5mL棕色量瓶中用甲醇定容，制備成含有三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、丹酚酸B的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.2供試品溶液的制備取本品軟膠囊4粒，剪開，將內(nèi)容物置于小燒杯中，搖勻以后用10mL環(huán)己烷將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，70%乙醇萃取3次，每次15mL，合并下層液蒸干，使用甲醇定容至10mL容量瓶中，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3陰性樣品的制備剔除三七丹參藥材制成內(nèi)容物，并進(jìn)行分析。

2.2.4色譜條件1)色譜條件篩選：由于三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的液相條件基本相同，所以本實(shí)驗(yàn)主要篩選與丹酚酸B相適應(yīng)的色譜條件。波長篩選：藥典規(guī)定，203nm為三七皂苷R1和人參皂苷Rg1測定波長，286nm為丹酚酸B的測定波長，分別在上述波長條件下對丹酚酸B進(jìn)行6次含量測定(表1)；洗脫液比例的篩選：分別于乙腈∶0.05%磷酸水溶液體積比為19∶81及21∶79的流動相比例下6次比較分離度與Rg1出峰總時間(表2)。

表1液相波長選擇

Table1Liquidwavelengthselective

表2液相洗脫劑比例選擇

Table2Liquideluentproportionalselection

2)色譜條件選擇：由表1可知，丹酚酸B在203nm波長處的測定含量與藥典規(guī)定283nm波長處測得的含量無顯著性差異(P>0.05)，同時203nm又是藥典規(guī)定的三七皂苷R1和人生皂苷Rg1的測定波長，因此最終選取203nm作為本品的測定波長；對于流動相的選擇，在使用21∶79的流動相與其20∶80的洗脫劑比例下相比較P<0.05，分離度具顯著性差異，與19∶81相比較而言，且分離時間較短，故使用21∶79的流動相。篩選后的液相色譜條件：色譜填充柱：AgilentTC-C18(2)(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：V乙腈∶V0.05%磷酸水溶液為21∶79；檢測波長：203nm；流速：1mL/min；柱溫：20℃；進(jìn)樣量：10μL；理論塔板數(shù)：按三七皂苷R1色譜峰計(jì)算不得低于4000。

3)測定方法：精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10μL注入高效液相色譜儀，按照上述色譜條件分析。結(jié)果顯示，在供試品的色譜中，與對照品色譜相同位置上出現(xiàn)相同保留時間的色譜峰，且陰性溶液無干擾(圖2、圖3、圖4)。

2.2.5線性關(guān)系考察分別量取適量三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和丹酚酸B的標(biāo)準(zhǔn)品，于5mL 棕色量瓶中用甲醇定容，制備成三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和丹酚酸B含量分別為0.241mg/mL、0.462mg/mL和0.304mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取5μL、10μL、15μL、20μL進(jìn)樣，以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析。得3種成分的線性回歸方程，3種成分分別在1.205μg～4.820μg、2.310μg～9.240μg、1.520μg～6.080μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(表3)。

2.2.6精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液10μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣(n=6)，分別測定峰面積，計(jì)算得其RSD值為0.3581%，表明此方法精密度良好。

表33種有效成分的線性回歸方程

Table3Linearregressionequationofthreeactiveingredients

2.2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)稱取同一批次抗氧化軟膠囊，每次1g，用“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再進(jìn)行含量測定分析，結(jié)果樣品中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和丹酚酸B量平均值分別為8.32mg、21.88mg和11.21mg(n=6)，RSD值為0.6361%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取放置0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h的供試品溶液10μL，按照“2.2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)行樣品分析，分別測定其色譜峰面積。結(jié)果顯示，RSD值為0.9435%，供試品溶液在24h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.2.9加樣回收率實(shí)驗(yàn)分別稱取抗氧化軟膠囊內(nèi)容物6份，制備成樣品，并且加入適量的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品，在“2.2.4”項(xiàng)液相色譜條件下測定和計(jì)算回收率，其結(jié)果見表4。

表4回收率試驗(yàn)測定結(jié)果

Table4Recoverytestmeasurementresults

2.2.10樣品含量測定對3批抗氧化軟膠囊中3種成分的含量進(jìn)行測定，制備方法同供試品的制備，結(jié)果如表5。

表5抗氧化膠囊中3種成分的含量測定結(jié)果

Table5Contentofantioxidantcapsulesthreecomponentsofthemeasurementresults

3　討論

3.1　高效液相條件的篩選

分別在286nm、203nm處對樣品進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，含量差異較小，且在波長203nm處3種有效成份均可出峰；對于洗脫劑的比例進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)，在V乙腈∶V0.05%磷酸水溶液為20∶80時出峰整體時間較長，在V乙腈∶V0.05%磷酸水溶液為19∶81的洗脫條件下3種有效成分的分離度較小，故選擇波長203nm，洗脫劑為乙腈：0.05%磷酸水溶液，且比例為21∶79；對液相色譜柱的柱溫也進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柱溫低于25℃時較好，在20℃最佳，故選用20℃作為最適柱溫。

3.2　樣品的處理

在供試品制備時，本試驗(yàn)選取單因素考察法，以三七皂苷R1與人參皂苷Rg1含量為指標(biāo)，對萃取液中乙醇用量、乙醇濃度2個因素進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，最佳提取條件是70%乙醇萃取3次。

綜上所述，該方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于抗氧化軟膠囊的質(zhì)量控制。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部[K].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015.

[2]刁璇,肖麗和,林亞珠,等.多波長UPLC法同時測定冠心丹參膠囊中三七皂苷R1等5種有效成分的含量[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2015,(6):8.

[3]周芳芳,孟慶紅.HPLC法測定田七痛經(jīng)膠囊中人參皂苷Rg1的含量[J].航空航天醫(yī)學(xué)雜志,2011,22(1):120-121.