陳英紅，王穎，姜瑞芝，張曉熒

(1．吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長春130012；2．吉林大學(xué)第一醫(yī)院，長春130021)

凝血酶凍干粉是從豬血中提取的凝血酶原經(jīng)激活而獲得的供口服或局部止血用的無菌凍干制品，它能將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，通過胃腸道吸收直接作用于出血病灶，使得病灶表面的血液很快形成穩(wěn)定的凝血塊，從而有效控制出血。此外，凝血酶還能促進(jìn)出血血管局部上皮細(xì)胞生長，加速傷口愈合，是當(dāng)前臨床比較普遍使用的止血藥物，被國家列為基本藥物[1，2]，用于消化道出血[3，4]、腦出血[5～7]、咯血[8，9]等?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中只進(jìn)行了效價測定。根據(jù)《化學(xué)藥品注射劑和多組分生化藥注射劑基本技術(shù)要求》(國食藥監(jiān)注[2008]7號)中相關(guān)規(guī)定及公司進(jìn)一步提高產(chǎn)品質(zhì)量的可控性，擬進(jìn)行凝血酶凍干粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升。蛋白質(zhì)的分子量(Mr)的測定對于未知蛋白質(zhì)以及從生物組織或體液中提純的已知蛋白質(zhì)的鑒定必不可少[10～17]。因此，測定分子質(zhì)量及其分布對于凝血酶凍干粉的質(zhì)量控制和生產(chǎn)指導(dǎo)有重要意義。實驗中采用高效凝膠滲透色譜(HPGPC)法對凝血酶凍干粉的分子質(zhì)量及其分布進(jìn)行研究，從分子量角度來解析該產(chǎn)品的有效性。本實驗建立的HPGPC法 具有簡便、快速和重現(xiàn)性好的特點，為該產(chǎn)品質(zhì)控方法提供科學(xué)依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1　儀器

LC-10ATv高效液相色譜儀、SPD-10Avp檢測器(日本島津公司)；GPC專用工作站(北京龍智達(dá)科技開發(fā)有限公司)；KQ-100KDB超聲波清洗器(上海精密儀器儀表有限公司)；AB204-N分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2　試藥

肌球蛋白重鏈(批號：031M7688)、雞卵清白蛋白(批號：SLBC1095V)、碳酸酐酶(批號：071M19105V)、抑肽酶(批號：SLBC8763V)(Sigma公司)；牛血清白蛋白(批號：140619-201120)、細(xì)胞色素C(批號：14067-200501)(中國藥品生物制品檢驗所)；凝血酶凍干粉(國藥準(zhǔn)字：H22021551，批號：20140401、20140402、20140403、20140701、20140702、20140703，長春遠(yuǎn)大國奧制藥有限公司)；其他試劑均為分析純，水為超純水。

2　實驗方法

2.1　色譜條件

檢測器：紫外檢測器；波長：280nm；色譜柱：TSK GEL G2000 SW(7.5mm×300mm，10μm)；流動相：pH 6.86磷酸鹽緩沖液；流速：0.5mL/min；柱溫：30℃；理論板數(shù)按牛血清白蛋白峰計算不低于1500。

2.2　對照品溶液的制備

分別取肌球蛋白重鏈、雞血清白蛋白、牛血清白蛋白、碳酸酐酶、抑肽酶、細(xì)胞色素C對照品適量，加流動相分別制成5mg/mL的溶液，作為對照品溶液。

2.3　供試品溶液的制備

取本品適量，加流動相溶解并稀釋制成5mg/mL的溶液，搖勻，作為供試品溶液。

3　結(jié)果

3.1　標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取牛血清白蛋白等對照品溶液，分別在色譜儀上進(jìn)樣，記錄洗脫峰保留時間，由GPC軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)分子量的對數(shù)值為縱坐標(biāo)、以相應(yīng)色譜峰的保留時間為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Log(M)=6.5938-0.1340T，表明在相對分子質(zhì)量6512～200 000之間相對分子質(zhì)量對數(shù)與保留時間呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9956。

3.2　精密度試驗

直接吸取凝血酶凍干粉供試品溶液(批號：20140401)，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20μL，按上述條件測定，GPC軟件自動計算重均分子量(Mw)，供試品的Mw為84 767，RSD為0.73%(n=6)。結(jié)果表明，所用儀器精密度良好。

3.3　重復(fù)性試驗

取凝血酶凍干粉供試品(批號：20140401)6份，分別制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，自動計算Mw，供試品的Mw為84 551，其RSD為0.45%(n=6)。結(jié)果表明，本方法的重現(xiàn)性良好。

3.4　穩(wěn)定性試驗

取凝血酶凍干粉供試品溶液(批號：20140401)，分別放置0h、1h、2h、4h、8h、10h，精密進(jìn)樣20μL，按上述色譜條件測定Mw，供試品的Mw為84 786，RSD為0.33%(n=6)。結(jié)果表明，供試品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.5　凝血酶凍干粉重均分子量的測定

根據(jù)GPC標(biāo)準(zhǔn)曲線及供試品保留時間，采用GPC軟件計算，檢測6批樣品Mw在80ku～95ku之間(表1、圖1、圖2)。

表16批樣品重均分子量測定結(jié)果

Table 1 Molecular mass of lyophilizing thrombin powder

4　討論

4.1　檢測器考察

試驗中采用了常用的紫外檢測器、示差檢測器進(jìn)行考察，實驗結(jié)果顯示，示差檢測器是一種通用性檢測器，對與流動相折光系數(shù)不同物質(zhì)均有反應(yīng)，而樣品中的輔料對分子量測定結(jié)果有干擾，影響了測定結(jié)果的真實性，因此選擇紫外檢測器為試驗儀器。

4.2　波長的選擇

因樣品主要成分為蛋白類，故通過PDA檢測器進(jìn)行全波長掃描。取對照品及樣品的磷酸鹽緩沖溶液，在200nm～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，對照品和樣品在214nm和280nm波長處均有最大吸收，同時對214nm和280nm波長處色譜圖進(jìn)行了考察，結(jié)果214nm屬于末端吸收，峰雜，且214nm屬于肽類的吸收，而280nm波長色譜圖峰形較好，故選擇280nm為本試驗的測定波長。

4.3　色譜柱考察

選取TSK GEL G2000 SW(7.5mm×300mm，10μm)、SRT SEC-100(7.8mm×300mm，5μm)、Water BEH200(7.8mm×300mm，3.5μm)、SB 803HQ(8mm×300mm，10μm)4種規(guī)格的色譜柱，結(jié)果表明，采用蛋白類分離專用柱TSK GEL G2000 SW色譜柱，供試品中各組分色譜圖分離效果較好。

4.4　流動相考察

根據(jù)凝血酶凍干粉的溶解性及主要成分凝血酶為蛋白類組分，參考《中國藥典》2010年版一部“分子排阻色譜法”及相關(guān)文獻(xiàn)，考察pH 6.86磷酸鹽緩沖液、0.7%硫酸鈉溶液、純化水為流動相，試驗結(jié)果表明，以pH 6.86磷酸鹽緩沖液為流動相，供試品中各組分色譜分離圖效果較好。

4.5　色譜峰歸屬

凝血酶凍干粉色譜圖顯示7個色譜峰，根據(jù)對照品分子量及保留時間確定色譜峰1峰～3峰位分子量在95ku～44ku之間，色譜峰4峰位分子量為12ku，色譜峰5峰位分子量為6.5ku。根據(jù)分子量可推斷色譜峰1～峰5為蛋白質(zhì)，色譜峰6峰位分子量為204u，為氨基酸，色譜峰7為小分子雜質(zhì)。

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