陳 露,吐爾洪·買買提,木尼熱·阿布都艾尼,謝爾艾力·加帕爾
(新疆大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院 石油天然氣重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 烏魯木齊 830046)
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中空纖維三相液相微萃取熒光光度法測(cè)定綠豆芽中的吲哚類植物生長素
陳露,吐爾洪·買買提*,木尼熱·阿布都艾尼,謝爾艾力·加帕爾
(新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院石油天然氣重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆烏魯木齊830046)
摘要:基于中空纖維液相微萃取技術(shù),建立了綠豆芽中吲哚類植物生長素的熒光檢測(cè)方法。通過L9(34)正交實(shí)驗(yàn),對(duì)中空纖維液相微萃取條件進(jìn)行優(yōu)化,得到的優(yōu)化條件為:樣品溶液的pH值調(diào)為 4.0,萃取溶劑為正辛醇,接受相為pH 12.0的NaOH,攪拌速度為1 000 r/min,萃取時(shí)間為60 min。在最優(yōu)萃取條件下,吲哚類植物生長素的富集倍數(shù)可達(dá) 92 倍。供體相中吲哚類植物生長素的質(zhì)量濃度在 1.71~50.0 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.997 9,檢出限(S/N=3)為0.57 mg/L,樣品的加標(biāo)回收率為88.6%~100.7%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不大于 4.8%。該方法操作簡(jiǎn)單,環(huán)境友好,可用于綠豆芽中吲哚類植物生長素含量的準(zhǔn)確快速測(cè)定。
關(guān)鍵詞:中空纖維三相液相微萃??;吲哚類植物生長素;正交實(shí)驗(yàn);熒光光度法;綠豆芽
圖1 吲哚類植物生長素的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Molecular structure of indole phytohormonesn=1, 2, 3 represented IAA, IPA, IBA, respectively
植物生長素是植物體內(nèi)微量存在并調(diào)控植物生長﹑分化和發(fā)育的化合物[1]。吲哚類植物生長素是最先發(fā)現(xiàn)的可促進(jìn)植物生長的植物激素[2],主要包括吲哚乙酸(IAA)﹑吲哚丙酸(IPA)和吲哚丁酸(IBA),它們由不飽和芳香環(huán)和吲哚側(cè)鏈環(huán)組成[3],其結(jié)構(gòu)如圖 1 所示。由于植物體內(nèi)生長素的含量很低[4],并且容易被熱、光和氧降解,許多干擾基質(zhì)也會(huì)影響其直接測(cè)定,因此分離和富集對(duì)生長素含量的測(cè)定顯得尤為重要[5]。
提取植物激素的常用富集技術(shù)有固相萃取(SPE)[6]﹑固相微萃取(SPME)[7]﹑微波輔助萃取[8]﹑液相微萃取(LPME)[9]等。傳統(tǒng)的富集技術(shù)不僅操作繁瑣耗時(shí),而且需使用大量的有機(jī)溶劑,難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化[10]。SPME雖然可以克服上述缺點(diǎn),但使用成本高,存在交叉污染,不能直接與高效液相色譜(HPLC)聯(lián)用,因此應(yīng)用受到限制[11]。以多孔中空纖維為載體的液相微萃取(HF-LPME)是 20 世紀(jì) 90 年代由 Pederson-B jerggaard 首次提出的萃取技術(shù)[12],主要是通過有機(jī)溶劑在纖維壁孔中形成的液膜進(jìn)行傳質(zhì),在多孔的中空纖維腔內(nèi)進(jìn)行萃取[13]。中空纖維液相微萃取集采樣、萃取和濃縮于一體,具有富集倍數(shù)高、有機(jī)溶劑消耗少、樣品凈化能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),是一種環(huán)境友好的樣品前處理技術(shù)[14],已被廣泛應(yīng)用于食品[15]、環(huán)境[16]、醫(yī)學(xué)[17]等領(lǐng)域。
熒光檢測(cè)分析具有高靈敏度、高選擇性、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[18-19],適合于植物生長素的測(cè)定,Liu等[20]通過同步熒光法測(cè)定了果汁中 IAA 和 2-萘氧乙酸(BNOA)的含量。本文將三相中空纖維液相微萃取與熒光檢測(cè)結(jié)合測(cè)定了綠豆芽中的吲哚類植物生長素,該方法簡(jiǎn)化了樣品前處理過程,縮短了分析時(shí)間,提高了分析效率,使用少量的有機(jī)溶劑有效去除了基質(zhì)中復(fù)雜的干擾組分,簡(jiǎn)單快速,可用于綠豆芽中吲哚類植物生長素的痕量測(cè)定。
1實(shí)驗(yàn)部分
970CRT熒光分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);KQ5200B 超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);UV-1800紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司);1810-B 型石英自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海市中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司);pH 211 型酸度計(jì)(HANNA instruments),HC-2062 型高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);磁力攪拌器(法國,IKA color squid);Accurel Q 3/2 聚丙烯中空纖維(Membrana GmbH,Wuppertal,德國;壁厚 200 μm,孔徑 0.2 μm,內(nèi)徑 600 μm)。
IAA、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、9-蒽甲醇(9-NA)、1-萘乙酸(1-NAA)、1-芘丁酸(1-PBA)均購自百靈威科技有限公司,氫氧化鈉、無水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鈉、甲醇、正辛醇等購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,所有試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水(自制)。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1綠豆芽的培育稱取100 g 綠豆置于200 mL 燒杯中,用蒸餾水洗凈,置于暗處,提供適宜的溫度和濕度,每天定時(shí)換水2~3次,3天后,收集生長的豆芽,于-20 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2綠豆芽中植物生長素的提取取5 g 按上述方法培育的綠豆芽研磨,加20 mL NaH2PO4-H3PO4(pH 9.0)緩沖溶液,并在4 ℃ 下于暗處過夜提取植物生長素。然后將提取液在高速離心機(jī)中離心(9 000 r/min,5 min),收集上清液。逐滴加入1 mol/L的HCl,調(diào)上清液至所需pH值。
圖2 中空纖維液相微萃取示意圖Fig.2 Scheme of hollow fiber-liquid phase microextraction
1.2.3中空纖維萃取綠豆芽中吲哚類植物生長素將放有微型攪拌磁子的玻璃瓶固定于磁力攪拌器上,加入8 mL 樣品溶液,將中空纖維截成約8 cm長的小段,在丙酮中超聲清洗10 min,以去除中空纖維表面的雜質(zhì),然后將中空纖維用N2吹干。將中空纖維小段在正辛醇中浸泡5 min,使纖維孔壁充滿正辛醇,取出中空纖維后,用移液槍向中空纖維管內(nèi)定量注入一定濃度的NaOH溶液作為接受相,然后將中空纖維迅速浸入到樣品溶液中,用封口膜將進(jìn)樣口兩端密封,開啟恒溫磁力攪拌器,在一定攪拌速度下萃取一定時(shí)間后,用移液槍抽取50 μL 接受相,并定量稀釋,以激發(fā)波長λex=294 nm,測(cè)定發(fā)射波長λem=360 nm 處的熒光強(qiáng)度,根據(jù)熒光強(qiáng)度計(jì)算綠豆芽中吲哚類植物生長素的含量。實(shí)驗(yàn)裝置如圖2所示。
1.2.4正交實(shí)驗(yàn)為了更加有效地利用中空纖維萃取綠豆芽中吲哚類植物生長素,建立 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)水平因素表,以萃取時(shí)間、轉(zhuǎn)速、接受相NaOH的pH值和給體相HCl的pH值作為考察因素,通過單因素實(shí)驗(yàn),選出影響綠豆芽中吲哚類植物生長素提取效果的各因素中有意義的三水平,進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)(見表1),優(yōu)化萃取綠豆芽中吲哚類植物生長素的最佳測(cè)定條件。
針對(duì)上述問題,為了消除不匹配的線路電阻和不對(duì)稱負(fù)荷對(duì)電流分配的影響,本文提出了一種基于自適應(yīng)虛擬阻抗的分布式控制策略。該控制策略在傳統(tǒng)下垂控制的基礎(chǔ)上,結(jié)合本地和相鄰DG單元輸出的電流和初始虛擬阻抗值,根據(jù)系統(tǒng)特性自動(dòng)調(diào)節(jié)等效輸出虛擬阻抗,使接口變流器的虛擬電阻與線路電阻的和逐漸收斂于相同值,以實(shí)現(xiàn)電流的動(dòng)態(tài)均衡分配。另外,虛擬阻抗控制中由于線路電阻的影響帶來的電壓偏移,則通過添加電壓控制器利用動(dòng)態(tài)一致性觀察法進(jìn)行補(bǔ)償。
表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
2結(jié)果與討論
2.1分配系數(shù)的測(cè)定
分配系數(shù)(Ka/d)直接影響富集倍數(shù)、加標(biāo)回收率的大小。研究表明,兩相LPME只用于親脂性高或中等的化合物分析,其Ka/d通常大于 500,不適用于親水的中性分析物;而對(duì)于酸堿性分析物,需要三相LPME,通過控制供體相和接受相的 pH 值,使分析物以非離子化狀態(tài)存在,來提高分配系數(shù)。吲哚乙酸﹑吲哚丙酸和吲哚丁酸的分子結(jié)構(gòu)中均含有羧基,故選用三相 LPME 模式。以IAA 為代表物對(duì)兩相間的分配情況進(jìn)行考察,首先用等體積的正辛醇萃取 50 mg/L 的IAA-HCl溶液(pH 4.0),萃取完成后,收集有機(jī)層和HCl供體相,在λmax=280.0 nm 處測(cè)定吸光度。然后在有機(jī)層中加入等體積的 NaOH(pH 12.0)反萃取,再收集有機(jī)層和NaOH接受相,在λmax= 280.0 nm 處測(cè)定吸光度。根據(jù)中空纖維三相液相微萃取分配系數(shù)的定義,Ka/d=Korg/d×Ka/org,其中Ka/d為分配系數(shù),Korg/d為萃取達(dá)平衡時(shí)分析物在有機(jī)相的濃度與在樣品中濃度的比值,Ka/org為萃取達(dá)平衡時(shí)分析物在接受相中的濃度與在有機(jī)相中濃度的比值。計(jì)算可知,Korg/d=10.62,Ka/org=12.43,分配系數(shù)為132.29。結(jié)果表明,分析物在從水相萃取到有機(jī)相,然后從有機(jī)相反萃取到水相的過程中,均有較高的萃取率,可采用該體系萃取綠豆芽中的吲哚類植物生長素。
2.2萃取條件的優(yōu)化
表2 實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果
植物激素的提取液通常選用有機(jī)溶劑[21],如符繼紅等[22]采用 80%的甲醇溶液對(duì)擬南芥中的生長素進(jìn)行提取,Wang等[5]用80%的甲醇對(duì)綠豆樣品進(jìn)行預(yù)處理。本研究選擇NaH2PO4-H3PO4緩沖溶液作為提取液,分析物經(jīng)該緩沖溶液提取后,可直接作為給體相進(jìn)行萃取,而用有機(jī)溶劑提取時(shí),需先將有機(jī)溶劑蒸出,再將分析物重新用水相溶解配制給體相才能萃取。
吲哚類植物生長素包括吲哚乙酸、吲哚丙酸、吲哚丁酸等都具有吲哚環(huán)骨架結(jié)構(gòu)特征。紫外分光光度計(jì)和熒光分光光度計(jì)均可用于其測(cè)定分析,但因其在植物體內(nèi)含量很低,加之紫外檢測(cè)器的靈敏度較低,故本研究選用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。
正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果列于表2。從極差分析結(jié)果可看出,RC>RD>RB>RA,4個(gè)因素對(duì)提取率的影響大小依次為:NaOH的pH值(C)>HCl 的pH值(D)>轉(zhuǎn)速(B)>萃取時(shí)間(A),其中接受相NaOH的pH值影響較為顯著。中空纖維萃取的最佳條件為A1B3C3D3:即萃取時(shí)間為60 min,轉(zhuǎn)速1 000 r/min,接受相NaOH的pH值12.0,樣品的pH值為4.0 。按 A1B3C3D3條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),平均值為3.71 mg/L,高于表2中其他測(cè)試結(jié)果,故選擇A1B3C3D3為最佳萃取條件。
根據(jù)萃取過程分析,吲哚類植物生長素先被萃取到萃取劑正辛醇中,隨后在中空纖維界面遇堿離子化,再被反萃取到接受相NaOH中,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)吲哚類植物生長素的選擇性富集。吲哚類植物生長素分子結(jié)構(gòu)中含有羧基,當(dāng)供體相pH值為4.0 時(shí),它們大部分以分子狀態(tài)存在,極性減弱,減少了其在水中的溶解度,進(jìn)而增大了在萃取劑正辛醇中的分配。隨著接受相NaOH 濃度的增大,吲哚類植物生長素的離子化狀態(tài)逐漸增加,極性也隨之增加,當(dāng)接受相的pH值為12.0時(shí),吲哚類植物生長素達(dá)到最大離子化狀態(tài),大大降低了其在正辛醇中的溶解度,增大了在接受相中的溶解度,因此可以獲得最佳的萃取效率。
2.3線性范圍與檢出限
圖3 不同濃度加標(biāo)樣品的熒光光譜圖Fig.3 Fluorescence spectra of series spiked solutionλex/λem=294/360 nm;spiked concentration(1-6):0,5,10,15,30,50 mg/L;insert:calibration curve
對(duì)綠豆芽提取液樣品進(jìn)行梯度加標(biāo)實(shí)驗(yàn),分別配制0,5,10,15,30,50 mg/L的加標(biāo)樣品,在最優(yōu)萃取條件下測(cè)定,以熒光強(qiáng)度(F)對(duì)吲哚類植物生長素的質(zhì)量濃度(ρ,mg/L)進(jìn)行線性回歸,標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3插圖所示。方法的線性范圍為 1.71~50.0 mg/L,線性方程為F=14.264ρ+21.083,相關(guān)系數(shù)為0.997 9,檢出限(S/N=3)為0.57 mg/L。
2.4富集倍數(shù)與精密度
富集倍數(shù)為萃取完成后接受相中分析物的濃度與萃取前樣品中分析物的起始濃度之比。選擇0.1 mg/L的IAA-HCl(pH 4.0)樣品溶液進(jìn)行富集倍數(shù)的考察,在最優(yōu)的萃取條件下平行測(cè)定3次,得到富集倍數(shù)為92,3次測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為 5.0%。
2.5加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差
為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性,在最優(yōu)的萃取條件下進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。綠豆芽提取樣品的加標(biāo)濃度分別為5,15,30 mg/L,每個(gè)濃度平行測(cè)定3次,測(cè)定結(jié)果見表3。加標(biāo)回收率為88.6%~100.7%,測(cè)定值的RSD為 1.8%~ 4.8%,表明該方法有較高的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性,通過中空纖維液相微萃取能夠去除影響綠豆芽中吲哚類植物生長素測(cè)定的干擾物。
表3 綠豆芽樣品中吲哚類植物生長素的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.6實(shí)際樣品的測(cè)定
表4 綠豆芽中吲哚類植物生長素的含量
按照本方法對(duì)自培和購買的綠豆芽進(jìn)行樣品前處理,在最優(yōu)的萃取條件下分別測(cè)定了兩種綠豆芽中吲哚類植物生長素的含量,平行測(cè)定3次,測(cè)定結(jié)果見表4,測(cè)定值的RSD均不大于1.6%。自培和市售綠豆芽中吲哚類植物生長素的含量分別為7.25 μg/g 和8.20 μg/g,說明該方法可用于綠豆芽中吲哚類植物生長素的測(cè)定。
表5 方法的干擾實(shí)驗(yàn)
2.7干擾實(shí)驗(yàn)
為了驗(yàn)證方法的可行性,進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。干擾物的選擇根據(jù):①樣品中可能存在,并具有與目標(biāo)化合物相近的物理化學(xué)性質(zhì)和生物活性的物質(zhì),如2,4-D、1-NAA等生長素;②具有熒光性質(zhì)的酸性化合物,如9-NA 和 1-PBA,因?yàn)檫@類物質(zhì)可能會(huì)與目標(biāo)化合物一起被萃取與檢出。一般樣品中干擾物與目標(biāo)物濃度水平相當(dāng),本文選擇兩者濃度比例為10∶1,而且干擾物濃度大于其最大濃度值。向8 mL 綠豆樣品中分別加入 IAA、2,4-D、1-NAA、9-NA 和1-PBA 的甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液,IAA濃度為10 mg/L,其余化合物濃度均為100 mg/L,在最優(yōu)條件下萃取后測(cè)定,結(jié)果見表5。結(jié)果顯示,當(dāng)綠豆樣品中添加IAA 標(biāo)品時(shí),接受相的熒光強(qiáng)度比空白綠豆樣品增加了141.38,而添加物為2,4-D、1-NAA、9-NA 和 1-PBA時(shí),1-NAA引起的熒光強(qiáng)度變化最大,但其值僅為10.86;表明2,4-D、9-NA 和 1-PBA的加入基本不使熒光強(qiáng)度發(fā)生變化,由此可見,干擾物對(duì)吲哚類植物生長素的測(cè)定幾乎無影響。
2.8測(cè)定方法對(duì)比
將HF-LPME與已有方法進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果見表6。本方法的相關(guān)系數(shù)(0.997 9)高于其他方法,RSD小于SPE/GC-MS、MWCNT-HPLC和MAG-MIP-HPLC等方法,說明本方法獲得數(shù)據(jù)可以與HPLC、GC-MS 等高端儀器測(cè)得的數(shù)據(jù)相媲美,且該方法簡(jiǎn)單、快捷、重現(xiàn)性好,可用于綠豆芽中吲哚類植物生長素含量的測(cè)定。
表6 HF-LPME與其它方法的對(duì)比
a:hollow fiber-liquid phase microextraction-fluorescence;b:solid phase extraction/gas chromatography-mass spectrometry;c:multi-walled carbon nanotube-high performance liquid chromatography;d:molecularly imprinted monolayer-surface plasmon resonance, e:magnetic molecularly imprinted polymer-high performance liquid chromatography, f:high performance liquid chromatography-chemiluminescence
3結(jié)論
本文通過正交試驗(yàn),優(yōu)化了中空纖維萃取綠豆芽中吲哚類植物生長素的最優(yōu)條件,同時(shí)建立了吲哚類植物生長素的熒光檢測(cè)分析方法。取50 μL萃取完成后中空纖維中的接受相,用高純水稀釋至500 μL,在λex/λem=294/360 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度,用本方法萃取綠豆芽中的吲哚類植物生長素,操作簡(jiǎn)單﹑方便快捷,其線性范圍為1.71~50.0 mg/L(r=0.997 9),檢出限為0.57 mg/L,富集倍數(shù)為92,加標(biāo)回收率不小于88.6%。該方法可用于綠豆芽中吲哚類植物生長素含量的測(cè)定。
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Spectrofluorimetric Determination of Indole Phytohormones in Bean Sprout Using Three Phase Hollow Fiber-Liquid Phase Microextraction
CHEN Lu, TURGHUN Muhammad*, MUNIRA Abuduani, SHIRALI Jappar
(College of Chemistry & Chemical Engineering, Xinjiang University, Key Laboratory of Oil and Gas Fine Chemical,Educational Ministry of China, Urumqi830046, China)
Abstract:A new method using three phase hollow fiber-liquid phase microextraction was developed for the determination of indole phytohormones in bean sprout by spectrofluorimetry.The parameters affecting liquid phase microextraction performance were optimized using L9(34)orthogonal experiment.The optimum extraction was achieved by adjusting sample solution pH value to 4.0, using 1-octanol as organic extraction solvent, pH 12.0 solution as acceptor phase, and stirring the solution at 1 000 r/min for 60 min.Under the optimum conditions, the calibration curve showed a good linearity(r=0.997 9) in the range of 1.71-50.0 mg/L, with a detection limit of 0.57 mg/L.Recoveries for spiked samples from 88.6%to 100.7%were obtained with RSDs not more than 4.8%.The proposed method was simple, green and accurate in the determination of indole phytohormones in bean sprout.
Key words:hollow fiber three phase liquid phase microextraction;indole phytohormones;orthogonal experiment;spectrofluorimetry;bean sprout
中圖分類號(hào):O657.3;S963.732
文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A
文章編號(hào):1004-4957(2016)02-0229-06
doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.02.016
*通訊作者:吐爾洪·買買提,博士,教授,研究方向:分析化學(xué),Tel:0991-8582654,E-mail:turghunm@sina.com
基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21365020;21565025)
收稿日期:2015-07-15;修回日期:2015-08-19