匡勝男，羅　映，田小燕，張　璐，楊　洋，楊俊卿

( 重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點實驗室，重慶　400016)

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美洛昔康改善慢性應(yīng)激大鼠抑郁行為的機制初探

匡勝男，羅映，田小燕，張璐，楊洋，楊俊卿

( 重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點實驗室，重慶400016)

中國圖書分類號：R-332；R322.81；R392.12；R749.420.5；R971.4

摘要：目的初步探討美洛昔康對慢性應(yīng)激大鼠抑郁行為的影響及其機制。方法采用42 d慢性溫和不可預(yù)知的刺激方法建立大鼠抑郁模型，美洛昔康(1、3 mg·kg-1)和舍曲林(5 mg·kg-1)在造模開始21d后灌胃給藥，每天1次，連續(xù)21d。曠場實驗和強迫游泳實驗檢測大鼠行為學(xué)變化，酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠皮層PGE2、TNF-α含量變化，高效液相色譜法(HPLC)分析大鼠皮層NE、DA、DOPAC、5-HIAA的含量變化，免疫組化法檢測皮層5-HT1AR的表達變化。結(jié)果 與正常組比較，慢性應(yīng)激大鼠在曠場實驗中水平和垂直運動減少(P<0.01)，強迫游泳實驗中靜止不動時間延長(P<0.01)，皮層中PGE2、TNF-α含量增加(P<0.01)，NE、DA、DOPAC、5-HIAA的含量明顯減少(P<0.01)，同時5-HT1AR(P<0.05)的表達減少。與模型組相比，美洛昔康能明顯改善CUMS大鼠的抑郁行為，降低大鼠皮層PGE2與TNF-α含量(P<0.01)的同時增加NE、DA、DOPAC和5-HIAA含量(P<0.05或P<0.01)，上調(diào) 5-HT1AR的表達(P<0.01)。結(jié)論美洛昔康能明顯改善CUMS誘導(dǎo)的大鼠抑郁行為，其機制可能與其改善皮層炎癥反應(yīng)損傷，重建單胺遞質(zhì)系統(tǒng)平衡有關(guān)。

關(guān)鍵詞：抑郁； CUMS；美洛昔康；炎癥反應(yīng)；細胞因子；5-HT1AR；NE；DA；DOPAC；5-HIAA

抑郁癥是以明顯而持久的心境低落為主要臨床特征的心境障礙疾病。隨著現(xiàn)代社會生活與工作的壓力越來越大，抑郁癥的發(fā)病率逐漸提高，預(yù)計到2020年，抑郁癥將會成為繼心腦血管疾病后的第二大致殘性疾病[1]。目前臨床的治療手段遠不能達到有效治愈的目標(biāo)，多達65%的抑郁患者遭受反復(fù)發(fā)作的痛苦[2]。因此，深入探討抑郁癥的發(fā)病機制，尋找更加有效的預(yù)防策略及治療方案成為目前關(guān)注的焦點。

嚴重或持久的應(yīng)激對健康十分不利，尤其是慢性應(yīng)激是誘發(fā)抑郁癥的重要因素[3]。應(yīng)激所致抑郁的發(fā)生機制非常復(fù)雜，其中免疫炎癥抑郁假說提出內(nèi)部炎性狀態(tài)以及各種生理、心理性外部刺激等，在激活機體的免疫系統(tǒng)之后，提高炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激水平，從而參與調(diào)控抑郁癥的發(fā)生發(fā)展過程[4]，這為抑郁癥病因?qū)W提供了新方向，也開啟了炎癥因子拮抗劑和抗炎劑在抑郁癥治療中的實驗與應(yīng)用，其中環(huán)氧酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)抑制劑備受關(guān)注。COX-2是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵酶，在炎癥因子和有絲分裂原刺激下催化花生四烯酸(arachidonic acid，AA)生成前列腺素類(prostaglandins，PGs)產(chǎn)物，PGs通過各自特殊的G蛋白偶聯(lián)受體發(fā)揮不同生物學(xué)效應(yīng)[5]。迄今為止的研究指出，選擇性COX-2抑制劑在抑郁癥治療中具有較高的反應(yīng)率和緩解率[6]，而在和其他抑郁癥治療藥物的聯(lián)合運用中具有協(xié)同作用[7]。我們的前期實驗[8]也發(fā)現(xiàn)，選擇性COX-2抑制劑美洛昔康對慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁行為有明顯的改善作用，然而，其具體機制還不明確。應(yīng)激促發(fā)免疫炎癥反應(yīng)，使患者出現(xiàn)抑郁癥狀，動物表現(xiàn)出抑郁樣行為，這不僅與免疫炎癥誘導(dǎo)的細胞因子和炎癥介質(zhì)釋放增加影響神經(jīng)形成和HPA軸活化有關(guān)，還與其引起單胺類神經(jīng)遞質(zhì)如多巴胺(dopamine，DA)、去甲腎上腺素(norepinephrin，NE)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)等釋放關(guān)系密切[9]。那么，美洛昔康改善應(yīng)激大鼠抑郁行為的機制是否與皮層神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)相關(guān)呢？目前還尚未見研究報道。

為此本研究采用慢性溫和不可預(yù)知性應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)大鼠抑郁模型，在觀察美洛昔康對大鼠抑郁行為改變的基礎(chǔ)上，進一步觀察其對大鼠皮層組織中PGE2、TNF-α含量，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物NE、DA、3，4-二羥基苯乙酸(3，4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)、5-羥吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA)含量以及5-羥色胺1A 受體(5-hydroxytryptamine 1A receptor， 5-HT1AR)蛋白表達的影響，擬從炎癥反應(yīng)/單胺遞質(zhì)系統(tǒng)平衡方面初步探討美洛昔康的抗抑郁作用機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物選取清潔級♂SD大鼠50只，2月齡，體質(zhì)量180~220 g，購于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(渝)2012-0001。在標(biāo)準(zhǔn)的實驗環(huán)境下：溫度(22±2)℃，濕度(50±10)%，明暗交替各12 h。正常飲食飲水，飼養(yǎng)7 d以適應(yīng)實驗環(huán)境。

1.1.2主要藥品與試劑美洛昔康(昆山龍燈瑞迪制藥有限公司)，PGE2與TNF-α ELISA 試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)，山羊抗大鼠多克隆5-HT1A抗體(CST，美國)，SP試劑盒與DAB染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，NE、DA、DOPAC與5-HIAA標(biāo)準(zhǔn)品[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司]。

1.1.3主要儀器無蓋木制方箱，自制大鼠強迫游泳儀，-80℃超低溫冰箱(SANYO公司，日本)， ELX-800全自動酶標(biāo)儀( Bio-Tek公司，美國)，光學(xué)顯微鏡( Nikon公司，日本)，5810R超低溫離心機(Eppendorf公司，德國)，高效液相色譜儀(島津，日本)。

1.2方法

1.2.1分組與給藥正式實驗之前選取曠場實驗水平活動得分在40~100的♂清潔級SD大鼠50只，并將其隨機分為5組(n=10)，即正常對照組、模型組、陽性藥物對照組、美洛昔康1 mg·kg-1組和美洛昔康3 mg·kg-1組。分組完成后，正常對照組大鼠大籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由攝水進食且不給予任何刺激，其余4組大鼠孤養(yǎng)并給予42 d CUMS。從造模d 22開始，給藥組大鼠分別灌胃給予舍曲林(5 mg·kg-1)、美洛昔康(1、3 mg·kg-1)，模型組與正常組則以相同的方式給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na)，每天1次，連續(xù)給藥至42 d。大鼠每周稱1次體重，灌胃劑量根據(jù)體重調(diào)節(jié)。

1.2.2慢性溫和不可預(yù)知性應(yīng)激大鼠模型綜合文獻[8，10]所述方法并稍加改進后建立應(yīng)激抑郁大鼠模型。模型組、陽性藥物對照組、美洛昔康(1、3 mg·kg-1)組大鼠每籠單只飼養(yǎng)，連續(xù)給予42 d溫和刺激，包括：夾尾1 min、晝夜顛倒24 h、潮濕墊料24 h、禁食水24 h、冰水游泳(4℃，5 min)、熱水游泳(45℃，5 min)、噪聲(92 dB，1500 Hz)刺激2 h、鼠籠傾斜45° 24 h共8種刺激，每日隨機選擇一種，3 d內(nèi)不重復(fù)，刺激在同樓遠離飼養(yǎng)室房間給予。

1.2.3行為學(xué)測定(1)曠場實驗(open-field test)：實驗在安靜且可見度為5m的暗室中進行，實驗裝置為四周與底面均黑漆覆蓋，長×寬×高為100 cm×100 cm×50 cm的無蓋木箱，底部由白線均分為25個20 cm×20 cm 大小的方格。實驗開始時，大鼠被放置于中央方格內(nèi)，觀察其在300 s內(nèi)的活動情況：①水平運動(horizontal movement)：以穿行的方格數(shù)記錄水平運動次數(shù)，穿行方格的定義為大鼠4只腳都進入同一格子中。②垂直運動(vertical movement)：以大鼠后肢直立即兩前爪騰空或攀爬墻壁的總次數(shù)為垂直運動次數(shù)。每只大鼠測試完結(jié)束后，使用75%酒精對木箱底面進行清潔消毒。(2)強迫游泳實驗(force swimming test):將單只大鼠放入內(nèi)徑30 cm，高50 cm圓柱形透明水桶中，桶內(nèi)水深30 cm，水溫(24±2)℃。使其適應(yīng)游泳2 min后，從第3 min開始記錄大鼠300 s內(nèi)在水中靜止不動狀態(tài)持續(xù)時間，不動狀態(tài)是指大鼠在水中停止掙扎時呈漂浮的狀態(tài)，或為使其頭部浮在水面僅有細小的肢體活動。每只大鼠測試完后均清洗水桶并換水。

1.2.4PGE2、TNF-α含量檢測每組各隨機選取6只大鼠斷頭處死，用于PGE2、TNF-α含量測定。取皮層稱重后按質(zhì)量體積比1 ∶9加入PBS，于冰面玻璃勻漿器中勻漿，5 000×g，4℃離心5 min，取上清液，-20℃凍融，嚴格參照ELISA測試盒說明書測定PGE2和TNF-α含量。

1.2.5高效液相色譜法測定NE、DA、DOPAC、5-HIAA的含量變化與ELISA共用組織測定NE、DA、DOPAC、5-HIAA的含量，皮層臨用前解凍稱重，按照6 μL/mg加入0.1 mol·L-1高氯酸(內(nèi)標(biāo)濃度為1 mg·L-1)，用玻璃勻漿器勻漿，在4℃條件下，以20 000×g離心15 min，取上清液進樣20 μL。色譜的條件為：依利特ODS2色譜柱(E2118047，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為 A 乙腈 ∶B 水(含 0.1%甲酸)等度洗脫，0~3 min(10 ∶90V/V)，流速為 1 mL·min-1。

1.2.6免疫組化每組隨機選取4只大鼠灌注后取腦，于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，腦組織脫水后石蠟包埋，冠狀面切片約4 μm厚。免疫組化實驗觀察皮層5-HT1AR的表達情況，5-HT1A抗體濃度為1 ∶100。具體步驟按SP法操作進行， DAB顯色后中性樹膠封閉，顯微鏡下觀察蛋白陽性表達情況，用Image-pro plus 6.0軟件分析免疫組化圖片，將10×40倍光鏡下3個不同視野進行光密度分析。

2結(jié)果

2.1美洛昔康對慢性應(yīng)激抑郁大鼠水平和垂直運動的影響與正常組相比，CUMS組大鼠水平活動(P<0.01)和垂直活動明顯減少(P<0.01)；給予美洛昔康1 mg·kg-1連續(xù)灌胃21 d，大鼠水平活動(P<0.01)與垂直活動增加(P<0.05)，美洛昔康3 mg·kg-1組大鼠水平活動和垂直活動增加更明顯(P<0.01)，見Tab 1。

Tab 1　Effect of meloxicam on open-field

***P<0.01vscontrol；#P<0.05，##P<0.01vsCUMS

2.2美洛昔康對慢性應(yīng)激抑郁大鼠強迫游泳靜止不動行為的影響與正常組相比較，CUMS組大鼠靜止不動時間增加(P<0.01)，美洛昔康1、3 mg·kg-1治療能明顯減少大鼠不動時間(P<0.01)，見Tab 2。

Tab 2　Effect of meloxicam on forced

***P<0.01vscontrol；##P<0.01vsCUMS

2.3美洛昔康對慢性應(yīng)激抑郁大鼠皮層PGE2、TNF-α含量的影響與正常組比較，CUMS組大鼠皮層中PGE2、TNF-α含量明顯增加(P<0.01)；與CUMS組相比，美洛昔康1 mg·kg-1組大鼠皮層組織PGE2(P<0.05)、TNF-α(P<0.01)明顯降低，美洛昔康3 mg·kg-1組PGE2、TNF-α含量減少更為明顯(P<0.01)，見Tab 3。

Tab 3　Concentration of PGE2

***P<0.01vscontrol；#P<0.05，##P<0.01vsCUMS

2.4美洛昔康對慢性應(yīng)激抑郁大鼠皮層NE、DA、DOPAC和5-HIAA含量的影響與正常組比較，CUMS組大鼠皮層中NE、DA、DOPAC、5-HIAA的含量明顯減少(P<0.01)；美洛昔康1 mg·kg-1組皮層DA和DOPAC含量明顯增加(P<0.05)，NE和5-HIAA含量有增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義； 美洛昔康3 mg·kg-1組NE(P<0.05)、DA(P<0.01)、5-HIAA(P<0.01)、DOPAC(P<0.01)的含量均明顯增加，見Tab 4。

2.5美洛昔康對慢性應(yīng)激抑郁大鼠皮層5-HT1AR蛋白表達的影響正常大鼠皮層組織中5-HT1AR陽性神經(jīng)細胞較多，胞質(zhì)染色較深，呈黃棕色。CUMS組大鼠皮層5-HT1AR陽性神經(jīng)細胞較少，且細胞質(zhì)染色較淺。COX-2抑制劑美洛昔康使給予組大鼠皮層5-HT1AR陽性神經(jīng)細胞增多，染色加深，見Fig 1。平均光密度值(average optical density，AOD)分析結(jié)果統(tǒng)計顯示，與正常組相比，CUMS組5-HT1AR(P<0.05)陽性神經(jīng)細胞AOD減少；與CUMS組相比，美洛昔康1 mg·kg-1組大鼠皮層5-HT1AR(P<0.05)陽性細胞AOD明顯增加，3 mg·kg-1美洛昔康組大鼠皮層5-HT1AR(P<0.01)陽性細胞AOD增加更明顯，見Fig 2。

Tab 4　Concentration of NE，DA，DOPAC and 5-HIAA of cortex in ±s，n=6)

***P<0.01vscontrol；#P<0.05,##P<0.01vsCUMS

Fig 1　Effect of meloxicam on 5-HT1AR protein expression of cortex in rats (400×)

Fig 2　Effect of meloxicam on 5-HT1AR

A:Control;B:CUMS;C:Sertraline (5 mg·kg-1); D: Meloxicam (1 mg·kg-1); E:Meloxicam (3 mg·kg-1).*P<0.05vscontrol group；#P<0.05,##P<0.01vsCUMS group

3討論

CUMS大鼠抑郁模型模擬了人類抑郁癥心境低落、動力低下、快感缺失、行為絕望等核心癥狀，目前廣泛應(yīng)用于抑郁癥發(fā)病機制研究、抗抑郁藥物篩選及新藥研發(fā)。本實驗通過CUMS方法建立大鼠抑郁模型，觀察美洛昔康改善抑郁大鼠行為與炎癥反應(yīng)/神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的關(guān)系。實驗結(jié)果表明，CUMS致大鼠曠場試驗中水平與垂直活動明顯減少，強迫游泳時靜止不動時間明顯延長，同時大腦皮層炎癥因子PGE2、TNF-α含量明顯增加，說明造模成功，且CUMS大鼠腦皮層出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，這與O’Connor等[11]的研究結(jié)果相似，心理應(yīng)激刺激機體免疫炎癥反應(yīng)激活，能升高外周及中樞情緒相關(guān)腦區(qū)內(nèi)炎性因子的濃度，從而引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，致使腦損傷加劇，證實了抑郁癥的發(fā)生與炎癥反應(yīng)激活密切有關(guān)。給予美洛昔康治療后，不僅改善了應(yīng)激大鼠的抑郁行為，還逆轉(zhuǎn)了皮層PGE2、TNF-α含量的升高，提示美洛昔康改善抑郁大鼠行為的作用機制可能在于抑制皮層COX-2酶活性的同時抑制炎癥反應(yīng)損傷，阻礙小膠質(zhì)細胞釋放炎癥因子，從而干擾炎癥反應(yīng)瀑布效應(yīng)造成的腦損傷[12]；也從另一方面提示抗抑郁治療可能與控制炎癥因子的表達關(guān)系密切。

NE、5-HT、DA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，對覺醒、情緒、記憶、疼痛、攝食和運動等多種正常生理過程起調(diào)節(jié)作用，因此神經(jīng)元突觸間隙單胺遞質(zhì)的濃度與其相應(yīng)作用時間的精密調(diào)節(jié)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的維持十分重要。一旦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)與其代謝物的釋放和相關(guān)受體表達受阻，則會直接導(dǎo)致NE能、DA能、5-HT能3個系統(tǒng)之間的功能紊亂，這是引起抑郁癥發(fā)生的重要因素，因此目前臨床上使用的大多抗抑郁藥物主要是通過升高單胺遞質(zhì)的水平而發(fā)揮作用。在我們的實驗中， CUMS致大鼠皮層NE、DA、DOPAC、5-HIAA的含量明顯下降，5-HT1AR表達減少，提示抑郁大鼠皮層出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)單胺的合成和降解、儲存和重攝取及其受體功能受到影響，導(dǎo)致單胺能神經(jīng)遞質(zhì)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)失衡，這與人類抑郁癥患者尸檢發(fā)現(xiàn)及抑郁癥患者腦脊液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平下降的結(jié)果相一致[13-14]。給予CUMS組大鼠COX-2抑制劑美洛昔康治療后，NE、DA、DOPAC、5-HIAA的含量明顯增加，5-HT1AR表達上調(diào)，提示美洛昔康改善應(yīng)激抑郁行為與其逆轉(zhuǎn)皮層單胺類神經(jīng)遞質(zhì)減少及恢復(fù)單胺能神經(jīng)元功能不足相關(guān)。

研究表明，促炎細胞因子及炎癥介質(zhì)(如PGE2)不僅能促進5-HT分解、5-HTlAR的表達減少，導(dǎo)致5-HT在突觸間隙的水平降低、利用受阻[15]，還會通過NO影響神經(jīng)系統(tǒng)四氫生物蝶呤的含量，進而使不同腦區(qū)DA的生成減少[16]。除此之外，逐漸增多的數(shù)據(jù)顯示炎癥還可影響神經(jīng)元五羥色胺轉(zhuǎn)運體(serotonin transporter，5-HTT)和去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體(norepinephrine transporter，NET)的活性等，如TNF阻滯劑能使類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者腦組織5-HTT密度減小[17]，這表明TNF對5-HTT的表達有影響，炎癥反應(yīng)能干擾5-HTT對5-HT的重攝取。這些研究表明炎癥反應(yīng)與單胺神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)關(guān)系密切。我們的結(jié)果，結(jié)合其他的研究報道，提示美洛昔康能重建CUMS大鼠皮層神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)平衡，可能與其減少皮層炎癥因子PGE2、TNF-α等的釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)相關(guān)。

綜上所述，美洛昔康能改善由CUMS引起的大鼠抑郁行為及皮層神經(jīng)損傷，可能與其抑制皮層炎癥反應(yīng)，改善單胺神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能紊亂相關(guān)。

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Effect of meloxicam on CUMS-induced depressive-like behavior in rats and its preliminary mechanism

KUANG Sheng-nan，LUO Ying，TIAN Xiao-yan，ZHANG Lu，YANG Yang，YANG Jun-qing

(DeptofPharmacology，KeyLaboratoryofBiochemistryandMolecularPharmacology，ChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China)

Abstract：AimTo explore the effect of meloxicam on the CUMS-induced depressive-like behaviors in rats and its preliminary mechanism.MethodsThe rats were exposed to CUMS procedure for 6 weeks to establish the model of depression. Meloxicam(1，3 mg·kg-1) and sertraline(5 mg·kg-1) were administered to rats from 22d of the stress procedure(once a day，for 21 days，p.o.). Depressive-like behaviors were evaluated by the open-field test and force swimming test. The levels of PGE2and TNF-α in cortex were measured by ELISA. Moreover，the concentrations of NE，DA，DOPAC and 5-HIAA were also measured by HPLC, and the protein expression of 5-HT1AR in cortex was analyzed by the immunohistochemistry.ResultsCompared with the rats of normal control group，the vertical and horizontal movement scores of rats in the open-field test were decreased and the immobility time in the forced swimming test was increased in model group. The levels of PGE2and TNF-α were both increased significantly，whereas the concentrations of NE，DA，DOPAC and 5-HIAA were decreased and the expression of 5-HT1AR was reduced in cortex. Compared with the rats of model group，meloxicam significantly improved the depressive behaviors of rats in experimental groups and reversed the content of PGE2，TNF-α，NE，DA，DOPAC and 5-HIAA，as well as the expression of 5-HT1AR.ConclusionMeloxicam has a significant protective effect on CUMS-induced depressive-like behaviors, and the protective mechanism might be related to attenuating inflammation response and reconstructing the balance of the monoamine neurotransmitter system in rat cortex.

Key words：depression；CUMS；meloxicam；inflammation；cytokine；5-HT1AR；NE；DA；DOPAC；5-HIAA

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)02-0263-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.022

作者簡介：匡勝男(1991-)，女，碩士生，研究方向：神經(jīng)精神藥理學(xué)，E-mail:754956832@qq.com；楊俊卿(1969-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，通訊作者，Tel:023-68485038，E-mail: 1139627371@qq.com

基金項目：重慶市科委項目(No cstc2012jjA0112)

收稿日期:2015-10-21，修回日期:2015-11-22

網(wǎng)絡(luò)出版時間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.044.html

網(wǎng)絡(luò)出版地址：2016-1-25 15:57