蘇　愛，朱紅燕，徐宏偉，劉　穎，梁　惠

(1.青島大學醫(yī)學院細胞與分子生物學實驗室，山東 青島　266071；2.山東省青島圣德腦血管病醫(yī)院，山東 青島　266100；3.青島市李滄區(qū)圣德老年護養(yǎng)院，山東 青島　266100；4.青島大學醫(yī)學院醫(yī)學營養(yǎng)研究所，山東 青島　266021)

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海兔素對大鼠原代肝細胞酒精性氧化損傷的保護作用

蘇愛1，朱紅燕2,3，徐宏偉1，劉穎1，梁惠4

(1.青島大學醫(yī)學院細胞與分子生物學實驗室，山東 青島266071；2.山東省青島圣德腦血管病醫(yī)院，山東 青島266100；3.青島市李滄區(qū)圣德老年護養(yǎng)院，山東 青島266100；4.青島大學醫(yī)學院醫(yī)學營養(yǎng)研究所，山東 青島266021)

中國圖書分類號：R-332；R151.41；R282.77；R322.47；R345.99；R575.01；R977.3

摘要：目的探討海兔素對大鼠原代肝細胞酒精性氧化損傷保護作用。方法門靜脈膠原酶Ⅳ原位灌注及密度梯度離心獲得大鼠原代肝細胞。MTT實驗檢測乙醇和海兔素最佳作用劑量及肝細胞活力。酶學實驗檢測細胞AST、LDH、SOD、MDA、GSH 水平；流式細胞術檢測細胞凋亡情況；單細胞凝膠電泳觀察細胞DNA損傷狀況；JC-1熒光探針檢測細胞線粒體膜電位水平；比色法及Western blot檢測細胞CYP2E1活性及蛋白表達。結果經30 mg·L-1海兔素預作用2 h，再與300 mmol ·L-1乙醇共作用8 h后，肝細胞活力較酒精模型組明顯上升，AST和LDH釋放也得到明顯抑制；同時，肝細胞SOD和GSH 水平明顯升高，MDA含量則明顯降低，差異均具有顯著性(P<0.05)。海兔素干預后，肝細胞凋亡率明顯降低，DNA損傷及線粒體膜電位水平明顯得到改善。 海兔素干預后，肝細胞CYP2E1活性及蛋白表達水平明顯受到抑制(P<0.05)。結論海兔素對大鼠原代肝細胞酒精性氧化損傷具有保護作用，其作用機制可能與海兔素抑制酒精對CYP2E1的活化，緩解氧化應激，提高機體抗氧化能力有關。

關鍵詞：海兔素；大鼠；原代肝細胞；酒精性損傷；抗氧化；凋亡；CYP2E1

長期過量酒精攝入可導致酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)的發(fā)生。ALD發(fā)病機制復雜，其中以細胞色素P450 2E1(CYP2E1) 活化及其引發(fā)的氧化應激損傷學說備受關注[1-3]。研究證實，萜類化合物具有抗炎、抗氧化、保肝等多種生物學活性[4-5]。本實驗室從三列凹頂藻中成功提取海洋天然活性物質溴代倍半萜海兔素，并對其保肝作用進行了研究。動物實驗結果表明，適宜劑量的海兔素可通過增強抗氧化能力、抑制CYP2E1活性及蛋白表達等，緩解氧化應激及脂質過氧化反應，對酒精誘導的大鼠肝組織損傷發(fā)揮良好保護作用[6]，但關于海兔素在肝細胞內抗氧化生物效應則少見報道。本實驗以海兔素為干預物，觀察其對酒精誘導的原代培養(yǎng)大鼠肝細胞損傷的保護作用，及其在細胞水平對CYP2E1活化及氧化應激的影響。

1材料與方法

1.1試劑與儀器海兔素由本實驗室從三列凹頂藻中提取純化，并經IR、13C- NMR，1H- NMR鑒定為溴代倍半萜海兔素(Aplysin)。無水乙醇(北京國藥集團化學試劑有限公司)；Ⅳ型膠原酶(Sigma)；Percoll(Solarbio)；AST、LDH、MDA、SOD、GSH檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒(江蘇碧云天生物技術研究所)；CYP2E1活性檢測試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)；兔抗CYP2E1 多克隆抗體(Abcam)；小鼠抗GAPDH多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)。熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；ELx808型酶標儀(美國BioTek公司)；TRANS-BLOT SD電轉膜儀(美國Bio-Rad公司)； UVI凝膠成像系統(英國UVItec公司)。

1.2大鼠原代肝細胞的獲取與培養(yǎng)♂ Wistar大鼠(180~200 g) ，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，動物合格證號為SCXK魯20130001。適應性喂養(yǎng)1周后，采用門靜脈膠原酶Ⅳ原位灌注術及Percoll密度梯度離心技術分離純化大鼠原代肝細胞，具體步驟如下。大鼠麻醉后打開腹腔，游離肝臟并行門靜脈留置針穿刺，用37 ℃預溫的Hanks’平衡鹽溶液350 mL，以34 mL·min-1流速灌注肝臟，直至肝臟變成土黃色。再以0.5 g·L-1膠原酶Ⅳ以同樣流速繼續(xù)灌注20 min。摘取肝臟，去除包膜，將細胞團塊輕柔地散落于4 ℃ Hanks’平衡鹽溶液中，200 μm 尼龍網過濾，4 ℃，150×g離心3 min，棄上清。將細胞沉淀加入DMEM/F12全培養(yǎng)液中(含體積分數為0.1的胎牛血清)，沿管壁小心將肝細胞懸液加入含體積分數為0.6的Percoll液表面， 4 ℃，600×g離心15 min。吸棄上層死細胞及其它雜質，保留下層純化的肝細胞，加入DMEM/F12全培養(yǎng)液重懸細胞，即得到主要為肝實質細胞的細胞懸液。行臺盼藍染色并計數，存活肝細胞占0.90 以上時可用于后續(xù)實驗。將新鮮獲取的肝細胞接種于涂有鼠尾膠原的96 孔培養(yǎng)板(1×104/孔)或6孔培養(yǎng)板(1×106/孔)，在37 ℃、5% CO2，高糖DMEM/F12全培養(yǎng)液(含青、鏈霉素，0.1 μmol·L-1氫化可的松，32 IE·L-1胰島素，體積分數為0.1的胎牛血清，15 mol·L-1HEPES液)中培養(yǎng)。4 h后更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)20 h用于后續(xù)實驗。

1.3乙醇及海兔素劑量的篩選

1.3.1乙醇劑量的篩選于96 孔板貼壁培養(yǎng)20 h 的肝細胞中，分別加入終濃度為0、100、200、300、400、500、600、700、800、900 mmol·L-1的無水乙醇，每個濃度設6 個平行復孔。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)4 h，每孔加入5 g·L-1MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，共持續(xù)8 h。培養(yǎng)結束后，吸棄上清液，每孔加入150 μL 二甲亞砜，室溫避光靜置10 min。于酶標儀490 nm 處測定各孔吸光度值(A)。細胞活力與吸光度值呈正比，實驗重復3 次。

1.3.2海兔素劑量的篩選于96 孔板貼壁培養(yǎng)20 h 的肝細胞中，分別加入終濃度為0、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg·L-1的海兔素，每個濃度設6 個平行復孔。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)4 h，通過以上MTT 實驗篩選出海兔素最佳作用劑量。實驗持續(xù)8 h，重復3 次。

1.4大鼠原代肝細胞酒精損傷模型的建立與海兔素干預實驗于6 孔或96 孔板中貼壁培養(yǎng)20 h 的肝細胞中，加入終濃度為30 mg·L-1的海兔素。于37 ℃、5% CO2孵育2 h后，加入終濃度為300 mmol·L-1的無水乙醇，與海兔素繼續(xù)共同作用8 h，同時設置正常對照組和酒精損傷組。作用完成后，對細胞及上清液進行相應處理，用于后續(xù)實驗。6 孔板每個濃度設3 個平行復孔，96 孔板每個濃度設6 個平行復孔，實驗重復3 次。

1.5海兔素對大鼠原代肝細胞酒精損傷細胞活力及受損程度影響采用MTT 實驗檢測各組肝細胞活力。采用酶法檢測上清液中谷草轉氨酶(AST)和乳酸脫氫酶(LDH)水平，具體步驟按試劑盒說明操作。

1.6海兔素對大鼠原代肝細胞酒精性氧化損傷的影響采用體積分數為0.01的Triton-X 100 裂解肝細胞，通過黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶(SOD)活力；硫代巴比妥酸比色法測定丙二醛(MDA)含量；DNTB比色法測定谷胱甘肽(GSH)水平；考馬斯亮蘭法進行蛋白定量。具體步驟按試劑盒說明操作。

1.7海兔素對大鼠原代肝細胞酒精誘導細胞凋亡的影響采用流式細胞術檢測肝細胞凋亡情況。收集肝細胞，調整細胞密度為1×109·L-1，吸取100 μL細胞懸液于分析試管中，加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI 溶液，室溫避光孵育15 min。加入400 μL 緩沖液，通過流式細胞儀分析細胞凋亡情況。數據經WinMDI2.9軟件分析，對細胞凋亡情況進行評價。

1.8海兔素對大鼠原代肝細胞酒精誘導DNA損傷的影響采用單細胞凝膠電泳技術檢測肝細胞DNA損傷。收集肝細胞，調整細胞密度為1×109·L-1，吸取100 μL細胞懸液，4 ℃、800×g離心5 min，將肝細胞沉淀重懸于1 mL 質量濃度為10 g·L-1低熔點瓊脂糖中，取75 μL滴加于預先鋪設質量濃度為10 g·L-1標準熔點瓊脂糖的毛玻璃片上，蓋上蓋玻片，置于4 ℃濕盒5 min。移去蓋玻片，將載玻片浸于預冷細胞裂解液(pH=10)中，4 ℃裂解1 h。將載玻片緩慢浸入電泳緩沖液(pH=13)中，4 ℃ 解旋40 min后，4 ℃，18 V電泳20 min。將載玻片浸入中和緩沖液中，4 ℃放置15 min。取出載玻片，滴加1 mg·L-1DAPI，4 ℃濕盒避光放置20 min，于熒光顯微鏡下觀察肝細胞DNA損傷狀況，并采用CASP軟件進行分析。根據肝細胞彗星尾DNA所占細胞總DNA百分比，將DNA損傷分為0 ~ Ⅳ級：<0.05為0級，0.05~0.2為Ⅰ級，0.21~0.4為Ⅱ級，0.41~0.95為Ⅲ級，>0.95為Ⅳ級。

1.9海兔素對大鼠原代肝細胞酒精損傷線粒體膜電位的影響將預置蓋玻片6 孔板中貼壁生長的肝細胞，加入1 mL培養(yǎng)液和1 mL JC - 1染色工作液，37 ℃、5% CO2孵育20 min，吸除上清，加入2 mL培養(yǎng)液，于熒光顯微鏡下觀察肝細胞線粒體膜電位變化。

1.10海兔素對大鼠原代肝細胞酒精損傷CYP2E1活性的影響收集肝細胞，調整細胞密度為1×109·L-1，采用比色法檢測肝細胞CYP2E1活性，測定步驟嚴格按試劑盒說明進行。

1.11海兔素對大鼠原代肝細胞酒精損傷CYP2E1蛋白表達水平的影響收集肝細胞，加入150 μL細胞裂解液提取總蛋白， BCA法測定樣品中蛋白濃度。蛋白樣品每孔上樣15 μg，經SDS-PAGE電泳分離后，電轉至PVDF膜。以質量濃度為50 g·L-1脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(CYP2E1，1 ∶1 000；GAPDH，1 ∶8 000)，4 ℃孵育過夜。加入二抗溶液(1 ∶8 000)，室溫孵育1 h，化學發(fā)光試劑盒顯影，Quantity One version 4.4軟件進行圖像分析，以GAPDH作為內參照。

1.12統計學處理采用SPSS 17.0統計軟件進行數據統計分析，多組比較采用單因素方差分析。

2結果

2.1大鼠原代肝細胞分離培養(yǎng)大鼠肝組織經門靜脈原位灌注后由暗紅色變?yōu)橥咙S色，肝被膜下可見明顯龜背狀裂隙(Fig 1)。此外，臺盼藍染色計數結果顯示，活細胞產量為(2.0±0.7)×107/肝，存活肝細胞均占0.90以上，可用于后續(xù)實驗。

Fig 1　Orthotopic rat liver perfusion

A: Liver before collagenase perfusion;B: Liver after collagenase perfusion

2.2乙醇及海兔素劑量篩選MTT結果顯示，100、200 mmol·L-1酒精模型組肝細胞活力分別較正常對照組(A=0.561±0.029)降低了1.07%和2.49%，經統計學處理，差異無顯著性(P>0.05)；300～900 mmol·L-1酒精模型組細胞活力分別較正常對照組下降了8.73%～76.47%，差異均具有顯著性(P<0.05)。因此，選擇300 mmol·L-1乙醇劑量用于后續(xù)實驗。此外，在肝細胞中加入海兔素后，10～30 mg·L-1海兔素組細胞活力與正常對照組(A=0.534±0.028)比較，差異均無顯著性(P>0.05)；35～50 mg·L-1海兔素組細胞活力則較正常對照組下降了7.31%～63.86%，差異具有顯著性(P<0.05)。因此，選擇30 mg·L-1海兔素劑量用于后續(xù)實驗。見Fig 2。

2.3 海兔素對大鼠原代肝細胞酒精損傷細胞活力的影響MTT 結果顯示，酒精模型組細胞活力較正常對照組(A=0.566±0.018)下降了8.83%，海兔素干預組則較酒精模型組(A=0.516±0.021)上升了7.56%，經統計學處理，差異均具有顯著性(P<0.05)。見Fig 3。

GroupAST/U·L-1LDH/U·L-1SOD/kU·g-1ProGSH/mg·g-1ProMDA/μmol·g-1ProControl1.56±0.184.37±0.265.36±0.38124.18±5.151.24±0.15Ethanol3.81±0.3212.08±0.73*1.86±0.13*78.96±5.37*3.57±0.38*Aplysin2.93±0.25*#6.28±0.89*#4.37±0.29*#118.04±8.87#2.98±0.20*#

**P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsethanol group

Tab 2　Effect of Aplysin on DNA oxidative damage in rat primary ±s,n=3)

**P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsethanol group

Fig 2　Effect of ethanol and Aplysin

A: Effect of ethanol on primary hepatocyte vitality;B: Effect of Aplysin on primary hepatocyte vitality.*P<0.05vscontrol group

2.4海兔素對大鼠原代肝細胞酒精損傷AST及LDH漏出的影響結果顯示， 酒精模型組AST和LDH漏出分別為正常對照組的2.44倍和2.76倍，海兔素干預組AST和LDH的釋放較酒精模型組降低了23.10%和48.01%，經統計學處理，差異具有顯著性(P<0.05)。 見Tab 1。

Fig 3　Effects of Aplysin on vitality

**P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsethanol group

2.5海兔素對大鼠原代肝細胞酒精性損傷的抗氧化作用結果顯示，酒精模型組SOD和GSH水平分別較正常對照組降低了65.30%和36.41%，MDA水平則達到正常對照組的2.88倍。與酒精模型組比較，海兔素干預組SOD和GSH 水平升高了13.49%和49.49%，MDA含量則降低了16.53%，經統計學處理，差異均具有顯著性(P<0.05)。見Tab 1。

2.6海兔素對大鼠原代肝細胞酒精誘導細胞凋亡的影響結果顯示，酒精模型組肝細胞凋亡率為(18.5±1.2)%，明顯高于正常對照組凋亡率(0±1.0)%，海兔素干預組肝細胞凋亡率明顯降低，達到(7.46±1.0)%，經統計學處理，差異均具有顯著性(P<0.05)。見Fig 4。

2.7海兔素對大鼠原代肝細胞酒精誘導DNA損傷的影響結果顯示，正常對照組肝細胞0~Ⅰ級DNA損傷率達到98%，Ⅱ~Ⅲ級僅為2%，無Ⅳ級損傷。酒精模型組肝細胞0~Ⅰ級DNA損傷率明顯降低，較正常對照組下降了37.2%，而Ⅱ~Ⅲ級和Ⅳ級損傷則明顯增多，分別較正常對照組升高了14.3和7.9倍。海兔素干預組肝細胞0~Ⅰ級DNA損傷率較酒精模型組升高了19.5%， Ⅱ~Ⅲ級和Ⅳ級DNA損傷率則較酒精模型組分別下降了25.5%和53.2%(P<0.05)。見Fig 5、Tab 2。

Fig 4Effects of Aplysin on apoptotic rate in alcohol primary hepatocyte injury in rats

A: Control; B: Ethanol; C: Aplysin

Fig 5 Effect of Aplysin on DNA oxidative damage in rat primary hepatocytes(×200)

A:Control; B:Ethanol; C:Aplysin

2.8海兔素對大鼠原代肝細胞酒精損傷線粒體膜電位的影響結果顯示，正常對照組肝細胞出現橙紅色熒光，而酒精模型組橙紅色熒光較正常對照組明顯減少，綠色熒光明顯增多，海兔素干預組橙紅色熒光則較酒精模型組增多，綠色熒光明顯減少。見Fig 6。

2.9海兔素對大鼠原代肝細胞酒精損傷CYP2E1活性的影響結果顯示，正常對照組CYP2E1活性為(38.67±4.53) μmol·g-1Pro·min-1，酒精誘導后，肝細胞CYP2E1活性達到正常對照組的2.69倍，而海兔素干預組肝細胞CYP2E1活性較酒精模型組明顯降低了23.44%，差異均具有顯著性(P<0.05)。見Fig 7。

Fig 6Effect of Aplysin on mitochondrial membrane potentialin rat primary hepatocytes(×200)

A: Control; B: Ethanol; C: Aplysin

Fig 7　Effect of Aplysin on CYP2E1

**P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsethanol group

2.10海兔素對大鼠原代肝細胞酒精損傷CYP2E1蛋白表達的影響結果顯示，酒精模型組CYP2E1蛋白表達水平較正常對照組明顯升高(P<0.05)，而海兔素干預組CYP2E1蛋白表達水平明顯受到抑制，與酒精模型組比較，差異具有顯著性(P<0.05)。見Fig 8。

3討論

酒精被攝入機體后，約90%在肝臟代謝。作為一種強烈的氧化應激源，酒精在被代謝的同時也誘生出大量活性氧(ROS)，引發(fā)氧化應激損傷，導致肝臟炎癥、壞死甚至肝硬化，對機體造成嚴重不利影響[1,7]。大量研究表明，萜類化合物具有高度抗氧化活性。本實驗室前期研究表明，凹頂藻萜類化合物及其提取物溴代倍半萜海兔素對酒精引起的肝組織氧化損傷具有一定保護效應[5-6]。為了進一步探討海兔素在細胞水平所發(fā)揮的抗氧化生物效應，本研究以海兔素為干預物，觀察其對原代培養(yǎng)大鼠肝細胞酒精性氧化損傷的保護作用及其可能的作用機制。

Fig 8　Effect of Aplysin on CYP2E1 protein

1: Control; 2: Ethanol; 3: Aplysin.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsethanol group

LDH和AST釋放增加是肝細胞膜及線粒體損傷敏感評價指標之一。本研究結果顯示，300 mmol·L-1乙醇作用于大鼠原代肝細胞8 h，其上清液中LDH和AST釋放水平明顯升高，而30 mg·L-1海兔素的干預減少了LDH和AST的釋放，表明適宜劑量的海兔素對乙醇誘導的肝細胞損傷具有一定保護作用。

通常，機體由多種抗氧化酶和抗氧化劑組成一套完整的抗氧化系統，來清除體內多余的ROS和自由基或將其轉化為無毒的代謝產物，使機體免遭氧化應激損傷。其中， GSH是細胞內最豐富的抗氧化劑及自由基清除劑[8]，而SOD則被認為是維持機體氧化平衡，清除ROS的第一道防線。MDA是一種脂質過氧化終產物，也是活性氧對細胞膜損傷敏感評價指標之一。本研究結果顯示，在乙醇作用下，大鼠原代肝細胞GSH被大量消耗，同時SOD活力亦明顯下降， MDA含量則明顯升高；而經海兔素預處理的原代肝細胞與乙醇共孵育8 h后，其抗氧化物質明顯增多，MDA含量明顯減少，表明海兔素干預可有效改善乙醇誘導所致的大鼠原代肝細胞氧化-抗氧化失衡狀況，緩解肝細胞脂質過氧化損傷。

研究表明，酒精不但可誘導肝細胞發(fā)生氧化應激損傷，還可引發(fā)嚴重的凋亡損傷[9]，這主要是由于酒精代謝過程中產生的大量ROS使線粒體膜電位降低，細胞色素C(cytochrome C)被更多地釋放入胞質，引發(fā)caspase級聯效應，從而誘導肝細胞發(fā)生凋亡。本研究通過流式細胞術、單細胞凝膠電泳技術及JC-1熒光染料對酒精誘導的大鼠原代肝細胞凋亡率、DNA[10]及線粒體損傷等細胞凋亡狀況進行綜合分析發(fā)現，海兔素有效改善了原代肝細胞DNA及線粒體損傷狀況，對酒精誘導的肝細胞凋亡具有一定的緩解和修復作用，這可能與海兔素提高機體抗氧化能力，減少氧化應激損傷有關。

長期過量飲酒時，肝組織微粒體乙醇氧化酶系(MEOS)成為乙醇代謝的主要途徑，其中，CYP2E1由于對乙醇代謝Km值較低，且能被乙醇誘導，故成為MEOS乙醇代謝酶系的關鍵酶。大量研究證實，由乙醇誘導的CYP2E1異?；罨瓦^表達與肝組織氧化應激損傷密切相關[3,11]。研究表明，將乙醇作用于HepG2細胞株，可導致CYP2E1酶活性和蛋白表達明顯升高；采用CYP2E1抑制劑處理大鼠肝細胞可預防乙醇毒性，且活性氧也明顯減少[12]；酒精對CYP2E1基因敲除小鼠幾乎不引起氧化損傷作用[13]，而肝特異性CYP2E1高表達的轉基因小鼠則表現出更多氧化應激反應[14]。 本研究結果表明，在乙醇作用下，大鼠原代肝細胞CYP2E1活性明顯增強，其蛋白表達水平亦明顯升高，海兔素對乙醇誘導的CYP2E1活性增強及蛋白過表達具有一定抑制作用，這可能是海兔素改善大鼠原代肝細胞氧化損傷及凋亡的作用機制之一。

綜上所述，海兔素對酒精誘導大鼠原代肝細胞氧化應激損傷表現出較強的保護作用，其作用機制可能與海兔素抑制酒精對CYP2E1的活化，緩解氧化應激，提高機體抗氧化系統活力有關。海兔素作為一種海洋天然活性物質，值得進一步研究開發(fā)和應用。

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Effects of Aplysin on ethanol-induced oxidative damage in rat primary hepatocytes

SU Ai1, ZHU Hong-yan2，3, XU Hong-wei1, LIU Ying1, LIANG Hui4

(1.LaboratoryofCellularandMolecularBiology,MedicalCollegeofQingdaoUniversity,QingdaoShandong266071,China;2.ShengdeCerebrovascularDiseaseHospital,QingdaoShandong266100,China;3.ShengdeGeriatricNursingHomes,QingdaoShandong266100,China;4.TheInstituteofHumanNutrition,MedicalCollegeofQingdaoUniversity,QingdaoShandong266021,China)

Abstract：AimTo investigate the protective effects of Aplysin on ethanol-induced oxidative damage in rat primary hepatocytes.MethodsRat primary hepatocytes were obtained via the portal vein collagenase Ⅳ in situ perfusion technique followed by a Percoll density gradient centrifuge. MTT test was used to determine the optimum dose of Aplysin and ethanol, and detect the cell vitality in primary hepatocytes. Supernatants of primary hepatocytes were harvested to measure AST and LDH level, and the SOD, GSH-PX activities and MDA content in primary hepatocytes were observed. Flow cytometry was used to detect the cell apoptosis rate. DNA damage in primary hepatocytes was detected by single-cell gel electrophoresis assay. The level of mitochondrial membrane potential in primary hepatocytes was tested by fluorogenic probe JC-1. The CYP2E1 activity in primary hepatocytes was detected by colorimetry. The proteins of CYP2E1 were detected by Western blot.Results300 mmol·L-1dose of ethanol and 30 mg·L-1dose of Aplysin were the optimal dosages and were used in the subsequent experiments. Hepatocyte vitality was significantly increased in Aplysin group compared to that in ethanol group, and Aplysin inhibited the release of AST and LDH(P<0.05). For Aplysin treatment group, the activities of hepatocyte SOD and GSH were significantly increased, and MDA was markedly lowered as compared with those in ethanol group(P<0.05). Aplysin could alleviate hepatocyte apoptosis significantly, and hepatocyte DNA damage rates of Ⅱ~Ⅲ level and Ⅳ level were significantly lowered in Aplysin treatment group as compared with those in ethanol group, and Aplysin had evident improvement in alcohol induced mitochondria damage of hepatocyte. Primary hepatocyte activities and protein expression of CYP2E1 were markedly lowered in Aplysin treatment group as compared with those in ethanol group(P<0.05).ConclusionAplysin has protective effects on liver oxidative damage induced by alcohol of primary cultured rat hepatocytes by blocking CYP2E1 activation, relieving oxidative stress, and sharpening the oxidation resistance ability.

Key words：Aplysin; rat; primary hepatocytes; alcoholic damage; antioxidation; apoptosis; CYP2E1

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)02-0251-07

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.020

作者簡介：蘇愛(1962-)，男，實驗師,研究方向：營養(yǎng)生化,E-mail:shenghua005@163.com;梁惠(1964-)，女，博士，教授，博士生導師，研究方向：醫(yī)學營養(yǎng)學，通訊作者，E-mail:qdlianghui@126.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 31171671, 81573137); 達能營養(yǎng)中心膳食營養(yǎng)研究與宣教基金(No DIC2014-03); 青島大學創(chuàng)新型教學實驗室研究項目

收稿日期:2015-11-09，修回日期：2015-12-02

網絡出版時間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.040.html網絡出版地址：2016-1-25 15:57