李俏然，唐　正，盧雪琳，劉小敏，梁曉秋

(1.南華大學(xué)腫瘤研究所，湖南 衡陽　421000；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床研究所，湖南 衡陽　421001)

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OSTP-DDP靶向抑制卵巢癌A2780細(xì)胞生長作用的研究

李俏然1，唐正2，盧雪琳1，劉小敏1，梁曉秋1

(1.南華大學(xué)腫瘤研究所，湖南 衡陽421000；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床研究所，湖南 衡陽421001)

中國圖書分類號：R329.24；R329.25；R737.310.22；R737.310.5

摘要:目的研究卵巢癌特異性結(jié)合肽(ovarian cancer specific targeting peptide, OSTP)與順鉑(cis-dichlorodiamineplatinum, DDP)偶聯(lián)物(OSTP-DDP)對卵巢癌A2780細(xì)胞的靶向抑制作用。方法化學(xué)合成OSTP-DDP，體外培養(yǎng)卵巢癌A2780細(xì)胞，采用CCK-8法分別檢測OSTP-DDP和DDP對卵巢癌A2780細(xì)胞的生長抑制作用；通過Annexin V-FITC凋亡試劑盒分別檢測OSTP-DDP和DDP對卵巢癌A2780細(xì)胞的周期和凋亡作用。結(jié)果通過質(zhì)譜分析和高效液相色譜(HPLC)分析，提示成功合成OSTP-DDP。CCK-8法檢測顯示，OSTP-DDP與DDP分別以不同濃度(10、20、40、80、160、320 μmol·L-1)處理卵巢癌A2780細(xì)胞24、48、72 h后，均可對該細(xì)胞的生長起到抑制作用，且呈時間、濃度依賴性。且OSTP-DDP的作用強(qiáng)于DDP(P<0.05)，提示OSTP-DDP具有靶向抑制細(xì)胞生長作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，經(jīng)OSTP-DDP和DDP處理后，細(xì)胞周期均被阻滯于G1期，作用72 h后，OSTP-DDP對卵巢癌A2780細(xì)胞的周期抑制作用強(qiáng)于DDP，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。作用24、48、72 h后，OSTP-DDP對卵巢癌A2780細(xì)胞凋亡的作用強(qiáng)于DDP(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示OSTP-DDP具有較強(qiáng)的靶向誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。結(jié)論OSTP-DDP對卵巢癌A2780細(xì)胞的生長具有靶向抑制作用，OSTP作為化療藥物靶向載體治療卵巢癌有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞:卵巢癌A2780細(xì)胞；OSTP-DDP；DDP；增殖抑制；凋亡；靶向治療

卵巢癌在女性生殖系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病率位居第三，但死亡率位居第一，雖然目前已有相當(dāng)多針對于卵巢癌治療的研究，但其仍然是一個致死性的疾病。因其前期多無有效的篩選方法，大多數(shù)患者確診時已經(jīng)處于晚期階段[1-4]。目前，臨床上治療卵巢癌最常用的化療藥物為順鉑，盡管該藥物在臨床上使用超過30年，但該藥的全身毒副作用，尤其是骨髓抑制、腎毒性和神經(jīng)毒性，仍然是限制本藥成為臨床上有效治療方法的一個重要因素[5]。因此，對于卵巢癌的靶向治療顯得尤為重要，同時也越來越受到重視。

本研究組利用體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)，篩選得到了卵巢癌特異性結(jié)合肽(ovarian cancer specific targeting peptide，OSTP)，短肽序列PHLATLF。通過體內(nèi)外實驗表明，OSTP對卵巢癌A2780細(xì)胞具有特異結(jié)合作用[6]。本文進(jìn)一步將OSTP與DDP偶聯(lián)，觀察其靶向抑制作用，為卵巢癌的靶向治療提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗材料卵巢癌A2780細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司；順鉑購自美國Sigma公司; DMEM高糖培養(yǎng)基、新生胎牛血清均購自美國Gibco公司； 胰蛋白酶購自長沙艾佳生物技術(shù)有限公司；CCK-8(Cell Counting Kit-8)試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自Roche公司。

1.2化學(xué)合成由生工生物工程(上海) 有限公司對OSTP-DDP進(jìn)行合成，并進(jìn)行高效液相色譜(HPLC) 分析和質(zhì)譜分析，對偶聯(lián)物的性質(zhì)進(jìn)行鑒定。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)將卵巢癌A2780細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 kU·L-1鏈霉素、100 kU·L-1青霉素的DMEM高糖完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長至80%~90%左右時，加入胰酶消化傳代，1周傳代2~3次。

1.4CCK-8法檢測細(xì)胞的生長抑制作用收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整濃度為 5×107·L-1，接種至96孔版中，每孔100 μL，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。待細(xì)胞貼壁且剛好鋪滿孔板底部，分別加入不同濃度的OSTP-DDP和DDP(10、20、40、80、160、320 μmol·L-1)，每組設(shè)5個平行復(fù)孔。置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入10 μL的CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在酶聯(lián)免疫檢測儀波長為450 nm處測定各孔吸光度(OD) 值。每個實驗重復(fù)3次。計算公式為：抑制率/%=[(對照孔-實驗孔)/(對照孔—空白孔)]×100%。OSTP-DDP和DDP均用DMSO溶解，所有實驗中的DMSO終濃度均小于0.01%?？瞻捉M在此僅為計算抑制率所需，故不在分組之列。應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，偶聯(lián)物的IC50值分別為24 h：55 μmol·L-1、48 h：29 μmol·L-1、72 h：25 μmol·L-1，順鉑的IC50值分別為24 h：88 μmol·L-1、48 h：47 μmol·L-1、72 h：43 μmol·L-1。

1.5流式細(xì)胞術(shù)分別檢測細(xì)胞周期和凋亡① 周期：不同濃度的OSTP-DDP和DDP(55、29、25 μmol·L-1)處理A2780細(xì)胞24、48、72 h后，常規(guī)胰酶消化， PBS洗2~3次，制成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至1×109·L-1。加入1 mL預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，800 r·min-1×5 min，吸凈上清。加入400 μL PBS，輕輕重懸細(xì)胞，使細(xì)胞分離為單個，逐滴加入預(yù)冷的無水乙醇1.2 mL，使其終濃度為75%，4℃放置過夜固定。取出固定的樣品，800 r·min-1，離心5 min，棄上清。加入1 mL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，800 r·min-1，離心5 min，離心收集細(xì)胞。重復(fù)1~2次，去除乙醇，加入150 μL PI(碘化丙啶)工作液，4℃ 避光染色30 min。轉(zhuǎn)至流式檢測管，上機(jī)檢測，PI用488 nm氬離子激光器激發(fā)，由630 nm通道濾光片接收，通過FSC/SSC 散點圖收集10 000個細(xì)胞，采用設(shè)門技術(shù)，排除黏連細(xì)胞和碎片，分析PI熒光直方圖上各細(xì)胞周期的百分率。② 凋亡：不同濃度的OSTP-DDP和DDP(55、29、25 μmol·L-1)處理A2780細(xì)胞24、48、72 h后，用不含EDTA的胰酶消化收集，用PBS洗滌細(xì)胞2次，每次2 000 r·min-1，離心5min，收集約1~5×105細(xì)胞，加入500 μL的Binding buffer 懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻，室溫、避光，反應(yīng)5~15 min，1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀觀察檢測。

2結(jié)果

2.1成功合成OSTP-DDP通過HPLC分析，純度>95%，OSTP-DDP中多肽序列正確，質(zhì)譜分析顯示，順鉑已偶聯(lián)成功，分子質(zhì)量為1 164.05，性狀為淺棕紅色粉末(Fig 1、2)。

2.2OSTP-DDP對卵巢癌A2780細(xì)胞的生長抑制作用OSTP-DDP與DDP分別以不同濃度(10、20、40、80、160、320 μmol·L-1)處理卵巢癌A2780細(xì)胞24、48、72 h后，結(jié)果顯示OSTP-DDP和DDP均可對A2780細(xì)胞有生長抑制作用，且呈濃度和時間依賴性。其中，經(jīng)濃度10、20、40、80 μmol·L-1處理后， OSTP-DDP對卵巢癌A2780細(xì)胞的生長抑制作用明顯強(qiáng)于DDP(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Tab 1)。OSTP-DDP的IC50值分別為24 h：55 μmol·L-1、48 h：29 μmol·L-1、72 h：25 μmol·L-1，DDP的IC50值分別為24 h：88 μmol·L-1、48 h：47 μmol·L-1、72 h：43 μmol·L-1。提示OSTP-DDP具有靶向卵巢癌A2780細(xì)胞生長的作用。

2.3流式細(xì)胞術(shù)分別檢測細(xì)胞周期和凋亡將不同濃度的OSTP-DDP和DDP(55、29、25 μmol·L-1)分別作用A2780細(xì)胞24、48、72 h后，結(jié)果顯示OSTP-DDP與DDP均可對卵巢癌A2780細(xì)胞產(chǎn)生周期抑制和誘導(dǎo)凋亡作用。且OSTP-DDP的效果明顯優(yōu)于DDP。作用48 h后，細(xì)胞周期被阻滯于G1期，OSTP-DDP與DDP兩者間無明顯差別；但作用72 h后，OSTP-DDP對卵巢癌A2780細(xì)胞的周期抑制作用強(qiáng)于DDP，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。作用24、48、72 h后，OSTP-DDP對卵巢癌A2780細(xì)胞凋亡的作用強(qiáng)于DDP，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見Tab 2,Fig 3、4。

Fig 1　The mass spectrometry of polypeptide in OSTP-DDP

Fig 2　The mass spectrometry of OSTP-DDP

Two mass spectral analyses show that the polypeptide in the OSTP-DDP has correct sequences, OSTP-DDP has correct molecular structures, the molecular weight is 1 164.05

3討論

卵巢癌是癌癥中引起女性死亡的重要原因之一，根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)的分期，卵巢癌原位癌的5年生存率可達(dá)90%以上，但擴(kuò)散至骨盆外后的5年生存率卻低至50%以下。卵巢癌的確診一般是在晚期(FIGO分期的三期和四期)，并且預(yù)后很差[7]。目前臨床上，順鉑是治療卵巢癌的一線藥物，但在使用該類藥物治療后，約有超過70%的患者出現(xiàn)了耐藥性以及嚴(yán)重的全身不良反應(yīng)[8]。因此，靶向治療藥物的研究和探索就顯得尤為重要。

Tab 1　The growth inhibitory effect of OSTP-DDP and DDP on ovarian cancer A2780 cells

**P<0.05vsDDP

Tab 2　Effects of OSTP-DDP and DDP on the cell cycle of A2780 cells

**P<0.05vsDDP

Fig 3　Cell cycle analysis of A2780 cells treated with OSTP-DDP and DDP

A: Figures of apoptosis. Left upper quadrant reveals cells which lose cell membranes but still have nucleus, left lower quadrant reveals living cells, right upper quadrant reveals apoptotic and necrotic cells in advanced stage, right lower quadrant reveals apoptotic and necrotic cells in early stage; B: The statistical chart.**P<0.01vsDDP

研究人員將博萊霉素和依托泊苷與順鉑結(jié)合，但隨后研究表明病人對該藥耐受性差，有嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)，并可能會導(dǎo)致腹部感染的發(fā)生。因其未能改善順鉑所帶來的全身毒副作用，并可能會增加其他的副作用，因此該治療方案并未取得突破性的進(jìn)展[9]。

還有一些研究將重點放在特殊通路抑制劑上，如mTOR抑制劑、激酶抑制劑、MAPK通路抑制劑等。研究人員發(fā)現(xiàn)，在低度惡性的卵巢癌中，Ras突變后，MAPK信號通路成為活化靶點，但該靶點的活化只存在于少部分的卵巢癌臨床分型1期[10]。因此，將MAPK信號通路作為作用靶點在臨床治療上是有一定困難的。另一方面，在血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)通路的靶向方面取得了一定的進(jìn)展,如貝伐單抗應(yīng)用于臨床3期的病人治療能明顯提高其生存率[11-12]。但VEGF抑制劑可引起瘤內(nèi)缺氧，誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)以及VM(類似于血管內(nèi)皮的腫瘤細(xì)胞形成的類血管)的形成，這些可能與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[13]。

噬菌體展示技術(shù)是近年來熱門研究的分子靶向治療技術(shù)，并且得到了長足的發(fā)展。研究人員利用隨機(jī)產(chǎn)生的DNA序列和分子生物技術(shù)，在噬菌體表面發(fā)現(xiàn)了大量不同的肽序列。噬菌體展示技術(shù)與傳統(tǒng)藥物篩選方法相比，其更具有簡單性、有效性和效率性[14]。而且噬菌體展示肽構(gòu)成了經(jīng)典生物學(xué)活性分子，如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、抗原和生長因子等的關(guān)鍵，從而促進(jìn)了不同的生物學(xué)進(jìn)程和通路的發(fā)展[15-16]。從1996年至今，研究人員利用噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)篩選出了多種與組織和腫瘤具有特異性結(jié)合的噬菌體肽[17-23]，為腫瘤的靶向治療提供了理論依據(jù)和基礎(chǔ)。但是一般來說，噬菌體展示肽需要修飾以后才能用于臨床，這是由于其自身性質(zhì)所決定的[24-25]。因此，本實驗室提出將OSTP與DDP相連，利用肽的靶向性將DDP更多地送入腫瘤內(nèi)，增加DDP的瘤內(nèi)含量，提高療效，同時減少DDP的全身毒副作用。

在前期實驗工作中，本實驗室已經(jīng)篩選出了卵巢癌A2780細(xì)胞特異性結(jié)合肽OSTP，并通過體內(nèi)外實驗驗證了其靶向性。本實驗在前期工作的基礎(chǔ)上，將OSTP與DDP偶聯(lián)，將不同濃度的OSTP-DDP與DDP(10、20、40、80、160、320 μmol·L-1)分別作用于卵巢癌A2780細(xì)胞。CCK-8實驗方法顯示，不同濃度的偶聯(lián)物對卵巢癌A2780細(xì)胞的生長均有抑制作用，24、48、72 h的IC50值分別為OSTP-DDP(55、29、25 μmol·L-1)，DDP(88、47、43 μmol·L-1)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示OSTP-DDP具有靶向作用。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期與凋亡顯示，經(jīng)OSTP-DDP處理的細(xì)胞周期抑制率與凋亡率明顯高于DDP組的細(xì)胞，并且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。進(jìn)一步說明了OSTP-DDP的靶向作用。由于卵巢癌對于鉑類藥物的耐藥性及鉑類藥物的全身毒副反應(yīng)較多，常常導(dǎo)致化療方案難以奏效，甚至失敗，而靶向藥物治療可以很好地減少甚至避免這些毒副反應(yīng)，減少患者的耐藥性，增強(qiáng)患者的耐受性，從而為臨床上癌癥患者的治療提供了新的方向。

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The inhibitory effect of OSTP-DDP on the growth of ovarian cancer A2780 cells

LI Qiao-ran1, TANG Zheng2, LU Xue-lin1, LIU Xiao-min1, LIANG Xiao-qiu1

(1.TumorResearchInstitute,UniversiityofSouthChina,HengyangHunan421000,China; 2.ClinicalResearchInstitute,theFirstAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina,HengyangHunan421001,China)

Abstract:AimTo study the growth inhibitory effect of the conjugate(ovarian cancer specific targeting peptide and cisplatin，OSTP-DDP) that targeting ovarian cancer cells A2780. MethodsUsing chemical method to synthesize OSTP-DDP, ovarian cancer cells A2780 were cultured in vitro, using CCK-8 method (Cell Counting Kit-8) to detect the growth inhibitory effect of ovarian cancer A2780 cells, which were disposed by OSTP-DDP and DDP. Annexin V-FITC was used to detect the cycle and apoptosis effect of ovarian cancer A2780 cells which were disposed by OSTP-DDP and DDP. ResultsAccording to the mass spectrometry and the high performance liquid chromatography (HPLC) analysis, OSTP-DDP was proved to synthesize successfully. CCK-8 assay showed that both OSTP-DDP and DDP could play the growth inhibitory effect and showed a concentration-dependent manner when cells were treated in different concentrations (10,20,40,80,160,320 μmol·L-1) respectively after 24 h, 48 h, 72 h. And the effect of OSTP-DDP was stronger than DDP (P<0.05), indicated OSTP-DDP had targeted cytostatic effect. The result of the flow cytometry showed that cell cycle was mostly arrested in G1phase after 72h treated by OSTP-DDP and DDP,the inhibitory effect of OSTP-DDP was stronger than DDP (P<0.05).The apoptosis effect of OSTP-DDP was stronger than DDP (P<0.01),suggested that OSTP-DDP had a stronger targeting apoptosis-inducing effect. ConclusionOSTP-DDP has the targeting growth inhibitory effect on the ovarian cancer cell A2780,OSTP as a chemotherapeutic drug targeting vector has a great prospect to treat ovarian cancer.

Key words:ovarian cancer cell A2780;ovarian cancer specific targeting peptide (OSTP) and cisplatin(DDP);DDP; growth inhibition; apoptosis; targeting therapy

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)02-0204-07

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.012

作者簡介：李俏然(1990-)，女，碩士生，研究方向：卵巢癌靶向治療，E-mail：857881181@qq.com;梁曉秋(1962-)，女，博士，教授，研究方向：卵巢癌靶向治療，通訊作者,Tel：0734-8281075，E-mail：liangxiaoqiu368@163.com

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81472449, 81101988)

收稿日期：2015-10-08，修回日期：2015-11-16

網(wǎng)絡(luò)出版時間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.024.html網(wǎng)絡(luò)出版地址：2016-1-25 15:57