吳 博,馮彥紅,劉重斌,趙惠玲,王一龍,陳錫文△

(1.溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,浙江溫州 325035;2.石家莊市婦幼保健院,河北 石家莊 050091;3.湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院生理教研室,浙江 湖州 313000)

解偶聯(lián)蛋白(uncoupling protein,UCP)是一類位于線粒體內(nèi)膜上的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,通過消除線粒體膜電位,使底物氧化與ADP磷酸化脫偶聯(lián),減少ATP的合成,進(jìn)而使能量以熱能的形式釋放[1]。由于UCP可能參與調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝,因此與肥胖發(fā)生發(fā)展的關(guān)系日益引起人們的關(guān)注。目前UCP已被列為肥胖癥的候選基因[2]。研究表明,經(jīng)過重復(fù)性“饑餓/再投喂”飼喂方式的處理,能激活大鼠體內(nèi)瘦素(leptin)調(diào)節(jié)能量平衡以控制體重這一調(diào)節(jié)系統(tǒng)[3]。禁食及各種與脂代謝相關(guān)的激素水平的改變,是研究與能量代謝相關(guān)的UCP表達(dá)調(diào)控因素的有利實(shí)驗(yàn)條件。本研究通過觀察經(jīng)過重復(fù)性“饑餓/再投喂”處理大鼠攝取高脂食物(可以誘導(dǎo)正常鼠產(chǎn)生單純性肥胖癥)時(shí),大鼠脂肪組織UCP2和肌肉組織UCP3的表達(dá)變化,旨在進(jìn)一步探討UCP對脂代謝的調(diào)節(jié)作用及其可能機(jī)制,為有效治療肥胖提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 葡萄糖(Glucose)、游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)測試盒,南京建成生物工程研究所;胰島素(Insulin)放射免疫試劑盒,北京北方生物技術(shù)研究所;Trizol試劑盒,美國 Invitrogen公司;BcaBESTTM RNA PCR Kit Ver.1.1,大連寶生物工程有限公司;PCR引物合成,上海捷瑞生物工程有限公司;山羊抗大鼠UCP2、UCP3和GAPDH多克隆抗體,美國Santa Cruz公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒,碧云天生物技術(shù)研究所;ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒,美國Thermo公司;其余試劑均為市售分析純。

1.1.2 儀器 7600型全自動(dòng)生化分析儀,日本日立公司;722型光柵分光光度計(jì),上海精密科學(xué)儀器公司;SN-695B型智能放免γ測量儀,上海核所日環(huán)光電儀器有限公司;DU530型核酸蛋白測定儀,美國Beckman Coulter公司;PCR儀、凝膠成像儀和垂直板電泳槽、轉(zhuǎn)移電泳槽,美國Bio-Rad公司。

1.2 動(dòng)物分組與處理

SPF級健康雄性SD大鼠60只,體重180～220 g,由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號:SCNK(浙)2005-0019。將大鼠隨機(jī)分為兩組:實(shí)驗(yàn)組(repeated fasting and refeeding,RFR)25只,對其進(jìn)行“重復(fù)性饑餓1天/再投喂1天,持續(xù)6周”的飼喂處理,隔天喂以基礎(chǔ)飼料;對照組(control)35只,每天喂以基礎(chǔ)飼料。第6周末,處死20只(RFR組和對照組各10只),RFR組剩余15只大鼠另6周改為每天喂以高脂飼料(10%豬油、2%膽固醇和88%基礎(chǔ)飼料)(RFR-CF/HF),并將對照組剩余25只大鼠再隨機(jī)分為兩組,一組改用高脂飼料(HF,15只),另一組繼續(xù)用基礎(chǔ)飼料(CF,10只)喂養(yǎng)至12周。實(shí)驗(yàn)期間每周定時(shí)稱量體重。第12周末,剔除RFR-CF/HF組和HF組體重增加位于各組后1/3的肥胖抵抗(dietary induced obesity resistant,DIO-R)大鼠10只 ,余30只處死。動(dòng)物處死前禁食12 h,用10%水合氯醛(0.3 ml/100g bw)麻醉后固定。每只大鼠腹主動(dòng)脈采血,分離血清和血漿,-20℃保存待測。于肝中葉剪下一小塊肝組織,置10%福爾馬林溶液中固定,用于形態(tài)學(xué)檢測。同時(shí)留取睪周白色脂肪與后肢骨骼肌,迅速置液氮凍存,然后轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱保存,以備RNA抽提和免疫印跡。

1.3 血液指標(biāo)檢測

日立7600型全自動(dòng)生化分析儀檢測血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的含量。采用比色法測定血清葡萄糖和游離脂肪酸。放免法檢測血漿胰島素的含量。所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 肝組織形態(tài)學(xué)檢測

肝組織常規(guī)石蠟包埋切片,HE染色,光鏡下觀察肝臟形態(tài)的改變。

1.5 RT-PCR檢測UCP2、UCP3 mRNA表達(dá)

采用Trizol法提取脂肪和肌肉組織總RNA,測定RNA濃度與純度后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,-20℃保存?zhèn)溆?。以適量反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板,在Taq DNA聚合酶催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。UCP2引物序列:上游 5'-GAGAGTCAAGGGCTAGCGC-3',下游 5'-GCTTCGACAGTGCTCTGGTA-3',擴(kuò)增片段 350 bp;UCP3引物序列:上游 5'-GTTGGACTTCAGCCATCAGAA-3',下游 5'-GTGGGTTGAGCACAGGTC-3',擴(kuò)增片段418 bp;GAPDH引物序列:上游5'-AACTCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3',下游 5'-ATGTCAGATCCACAACGGATACA-3',擴(kuò)增片段316 bp。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性 30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,循環(huán) 35次,最后72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像及定量掃描,用Gel-Pro Analyzer分析軟件進(jìn)行圖像分析,目的基因mRNA的相對含量以目的片段與相應(yīng)GAPDH mRNA積分吸光度的比值表示。

1.6 Western blot檢測 UCP2、UCP3蛋白表達(dá)

分別制備10%脂肪組織和肌肉組織勻漿,離心提取蛋白上清液。BCA法蛋白定量后將蛋白水平調(diào)成一致,加上樣緩沖液100℃變性5 min,于10%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,一抗4℃孵育過夜,二抗室溫孵育1 h后顯影成像分析。目的蛋白的相對含量以目的蛋白條帶與相應(yīng)GAPDH條帶積分吸光度的比值表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 體重變化比較

實(shí)驗(yàn)開始時(shí),兩組間體重?zé)o明顯差別,隨著喂養(yǎng)時(shí)間的推移,大鼠的體重差異逐漸增大。第6周末,RFR組體重顯著低于對照組(P＜0.01,表1)。實(shí)驗(yàn)期間,RFR-CF/HF組體重明顯增加,并逐漸接近CF組。第12周末,RFR-CF/HF組體重仍顯著低于HF組(P＜0.01),而略高于CF組(P＞0.05,表2)。

2.2 血液指標(biāo)比較

第6周末,RFR組血清葡萄糖含量顯著低于對照組(P＜0.05),FFA含量則顯著高于對照組(P＜0.01),但血脂、胰島素水平與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。第12周末,RFR-CF/HF組的血清TC、TG、LDL-C和血漿胰島素含量均顯著低于HF組(P＜0.01),而顯著高于 CF組(P＜0.05),其中LDL-C含量差異更顯著(P＜0.01),FFA含量則顯著低于HF和CF組(P＜0.01),但HDL-C、葡萄糖含量與其他兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,表3)。

2.3 肝組織形態(tài)學(xué)改變

光鏡下可見,RFR組、對照組和CF組肝臟組織結(jié)構(gòu)完整,肝小葉清晰,肝細(xì)胞索排列整齊,細(xì)胞分界清,核圓而清晰,胞質(zhì)豐富,無變性壞死、炎細(xì)胞浸潤及纖維組織增生。HF組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,肝索排列紊亂,肝細(xì)胞腫脹明顯,并伴有水腫變性及空泡狀變性,胞質(zhì)內(nèi)充滿大量脂肪空泡,界限不清,其內(nèi)細(xì)胞核固縮,顏色加深,小葉內(nèi)和匯管區(qū)可見炎細(xì)胞浸潤并伴有肝細(xì)胞壞死。RFR-CF/HF組肝細(xì)胞腫脹明顯減輕,可見散在炎細(xì)胞浸潤,肝細(xì)胞內(nèi)偶有小脂滴,脂肪變性程度較HF組明顯減輕(圖1見彩圖頁Ⅲ)。

2.4 UCP2、UCP3 mRNA表達(dá)水平比較

第6周末,RFR組脂肪組織UCP2 mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組(P＜0.05),肌肉組織UCP3 mRNA表達(dá)水平略高于對照組,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。高脂干預(yù)6周后,RFR-CF/HF組UCP2、UCP3 mRNA表達(dá)水平均顯著高于HF組(P＜0.01),但顯著低于CF組(P＜0.01,圖2)。

Tab.1 Comparison of body weight from the 1stweek to the 6thweek in each group of rats(g,±s,n=10)

Tab.1 Comparison of body weight from the 1stweek to the 6thweek in each group of rats(g,±s,n=10)

RFR:Repeated fasting and refeeding**P＜0.01 vs control group

Group 1stday 7thday 13thday 19thday 25thday 31stday 37thday 43rdday Control 192.25±9.27 271.33±10.59 308.25±15.00 338.00±16.72 366.00±16.87 382.92±19.26 396.50±25.28 412.25±24.42 R FR 193.83±10.63 198.58±6.63** 214.62±10.22**227.25±12.64**232.83±14.27**238.75±15.52**247.00±14.80**251.17±15.54**

Tab.2 Comparison of body weight from the 7thweek to the 12thweek in each group of rats(g, ±s,n=10)

Tab.2 Comparison of body weight from the 7thweek to the 12thweek in each group of rats(g, ±s,n=10)

HF:High-fat diet control;CF:Common-fat diet control;RFR-CF/HF:Common-fat diet repeated fasting and refeeding+high-fat diet treatment**P＜0.01 vs HF group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs CF group

Group 6thweek 7thweek 8thweek 9thweek 10thweek 11thweek 12thweek CF 420.17±21.79 437.17±23.17 453.92±22.82 469.08±23.70 480.25±22.92 490.17±22.62 501.83±22.73 HF 422.67±22.15 452.58±24.16 482.67±30.42## 515.50±31.78## 545.42±32.66## 578.92±32.47## 594.17±33.10##R FR-CF/HF 255.58±11.07**##337.67±13.69**##391.17±16.34**##423.75±16.51**##452.50±21.94**#485.00±24.78** 503.50±25.78**

Tab.3 Comparison of serum lipids,glucose,FFA,and plasma insulin in each group of rats(±s,n=10)

Tab.3 Comparison of serum lipids,glucose,FFA,and plasma insulin in each group of rats(±s,n=10)

TC:Total cholesterol;TG:Triglyceride;HDL-C:High-density lipoprotein cholesterol;LDL-C:Low-density lipoprotein cholesterol;FFA:Free fatty acid;RFR:Repeated fasting and refeeding;RFR-CF/HF:Common-fat diet repeated fasting and refeeding+high-fat diet treatment;HF:High-fat diet control;CF:Common-fat diet control*P＜0.05,**P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HF group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs CF group

Group Time(week)TC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)Glucose(mmol/L)Insulin(mU/L)FFA(μ mol/L)Control 6 1.65±0.18 0.58±0.22 0.98±0.08 0.37±0.19 34.92±2.56 20.71±3.75 78.91±47.62 R FR 6 1.72±0.13 0.62±0.23 0.92±0.09 0.43±0.16 29.81±2.53* 21.75±3.99 228.00±87.21**CF 12 1.69±0.12 0.60±0.10 0.94±0.13 0.40±0.06 31.18±7.50 22.93±2.05 128.41±11.26 HF 12 2.20±0.15△△ 0.91±0.13△△ 0.73±0.16△ 0.94±0.14△△ 49.89±±6.03△△ 48.33±5.42△△ 207.46±94.47 R FR-CF/HF 12 1.85±0.10##△ 0.77±0.07##△ 0.84±0.10 0.66±0.15##△△ 35.17±15.97 36.57±3.49##△△80.01±28.62##△△

Fig.2 Analysis of content of uncoupling protein 2(UCP2)and uncoupling protein 3(UCP3)mRNA in each group of rats

2.5 UCP2、UCP3蛋白表達(dá)水平比較

第6周末,RFR組脂肪組織UCP2和肌肉組織UCP3的蛋白表達(dá)水平均顯著高于對照組(P＜0.05)。高脂干預(yù) 6周后,RFR-CF/HF組UCP2、UCP3蛋白表達(dá)水平均顯著高于HF組(P＜0.05),但顯著低于CF組(P＜0.05,圖3)。

3 討論

Fig.3 Analysis of content of uncoupling protein 2(UCP2)and uncoupling protein 3(UCP3)protein in each group of rats

機(jī)體能量攝入與消耗的精細(xì)平衡是維持正常體重的關(guān)鍵,而UCP作為一種線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,其作用是將H+從線粒體內(nèi)膜滲漏到線粒體基質(zhì)中,減少ATP的合成并產(chǎn)生熱量[4],從而在調(diào)節(jié)產(chǎn)熱和能量代謝方面發(fā)揮重要作用。根據(jù)基因序列的同源性已發(fā)現(xiàn)五種解偶聯(lián)蛋白,分別為UCP1、UCP2、UCP3、UCP4和UCP5,其中UCP2、UCP3已被證實(shí)在體內(nèi)主要發(fā)揮產(chǎn)熱作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),老齡大鼠UCP2表達(dá)減少,產(chǎn)熱減少[5]。在UCP3基因敲除的小鼠,肌肉組織產(chǎn)生的質(zhì)子漏降低,產(chǎn)生的熱量減少[6]。UCP2和UCP3其他的作用包括:控制ROS的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)脂肪組織的代謝等作用,并且與基礎(chǔ)代謝率、肥胖和糖尿病密切相關(guān)。游離脂肪酸近年來被認(rèn)為可能是一種調(diào)節(jié)脂代謝的信號因子[7],UCP可能具有氧化脂肪酸的功能,也有可能是脂肪酸氧化的載體。因此,我們推測UCP的表達(dá)與脂代謝存在一定的關(guān)聯(lián),其表達(dá)上調(diào)可介導(dǎo)脂質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),降低游離脂肪酸酯化,并減輕蓄積脂質(zhì)的細(xì)胞毒性作用。

重復(fù)性“饑餓/再投喂”是一種能使機(jī)體對重復(fù)的代謝性應(yīng)激產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)的獨(dú)特實(shí)驗(yàn)方法。經(jīng)過這種飼喂方式處理的大鼠,血清游離脂肪酸、脂肪組織UCP2和肌肉組織UCP3基因及蛋白的表達(dá)水平均明顯升高,這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]。我們推斷,經(jīng)過重復(fù)性饑餓1 d/再投喂1 d的飼喂處理后,長時(shí)間的攝食不足導(dǎo)致體內(nèi)血糖降低,機(jī)體需要的能源物質(zhì)不足,組織開始以脂肪作為主要的能源物質(zhì),脂肪經(jīng)脂肪酶的水解作用分解出脂肪酸和甘油,血清中游離脂肪酸和酮體的含量升高;同時(shí)血糖降低時(shí),胰高血糖素、促腎上腺糖皮質(zhì)激素和促甲狀腺激素分泌增加[9],作用于脂肪細(xì)胞膜表面受體,激活腺苷酸環(huán)化酶,使細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量增加,激活依賴cAMP的蛋白激酶,使激素敏感性脂肪酶活化,增強(qiáng)脂肪動(dòng)員,從而使血糖維持在正常水平。機(jī)體組織再利用脂肪作為能源底物,氧化分解產(chǎn)生大量的H+,刺激UCP2表達(dá)升高,質(zhì)子泄漏增加,ADP磷酸化合成ATP效率下降,氧化與磷酸化脫偶聯(lián)而產(chǎn)生熱量,ATP生成減少,能量消耗和產(chǎn)熱增多。肌肉組織作為大鼠體內(nèi)耗氧量最高的組織,其能量供應(yīng)以氧化脂肪酸為主。血清中FFA含量的升高,同時(shí)亦可刺激肌肉組織UCP3的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),高脂飲食干預(yù)后,RFR-CF/HF組大鼠在恢復(fù)正常給食初段攝食量和體重迅速增加,之后攝食量開始減少,體重趨于穩(wěn)定,體重增加量明顯超過HF組,血清血漿促腎上腺皮質(zhì)激素和生長激素水平顯著升高,表現(xiàn)出旺盛的生長和發(fā)育態(tài)勢[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,RFR-CF/HF組大鼠血糖水平趨于正常,血清TC、TG、LDL-C、FFA含量及肝組織脂肪變性程度等各種指標(biāo)亦低于后者,表明高脂飲食引起的肥胖程度得到了一定程度的減輕。同時(shí)已有動(dòng)物研究顯示繼饑餓之后再得到食物,血清游離脂肪酸的含量下降,肌肉組織UCP2和UCP3的表達(dá)升高[10],這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。此外,高脂飲食導(dǎo)致RFR-CF/HF組大鼠較CF組血清胰島素分泌增加,脂肪分解作用抑制,脂肪動(dòng)員、血清游離脂肪酸含量及組織對脂肪酸的利用均減少,大鼠脂肪組織UCP2和肌肉組織UCP3基因及蛋白的表達(dá)水平均明顯降低,從而使能量消耗和產(chǎn)熱減少。

綜上所述,重復(fù)性“饑餓/再投喂”可減輕高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖程度,增加大鼠脂肪組織UCP2和肌肉組織UCP3基因及蛋白的表達(dá),上調(diào)由肥胖引起的質(zhì)子泄漏,提高大鼠的基礎(chǔ)能量代謝率。UCP作為能量代謝級聯(lián)反應(yīng)的最后分子組成部分,通過與機(jī)體能量平衡調(diào)節(jié)中樞的多種內(nèi)分泌因子相互作用而共同調(diào)節(jié)大鼠脂代謝,但其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討。

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