陳香梅,熊艷蕾,龔 輝,徐成麗

(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院,北京 100005)

隨著越來越多的平原人進入高海拔地區(qū)旅游或工作,低氧對男性生殖系統(tǒng)的影響應得到重視。國外報道:進入5 200m高海拔低氧環(huán)境的9名男性登山員,經(jīng)過7周的低氧暴露后其血漿睪酮水平顯著下降[1]。6名男性暴露于2 000～5 600 m高海拔低氧環(huán)境26 d后,返回海平面地區(qū)時及1個月后其精子計數(shù)顯著下降,精子畸形率顯著升高;精子活率在返回海平面地區(qū)時未有顯著變化,但1個月后精子活率顯著下降[2]。這些由低氧引起的睪酮水平降低和精子各項指標異常均可導致男性不育。

HIF-1α在低氧條件下產(chǎn)生并作為蛋白調(diào)節(jié)因子與多種靶基因結合調(diào)節(jié)其轉錄活性,介導組織細胞產(chǎn)生一系列的缺氧適應性反應[3]。哺乳動物睪丸內(nèi)精子的發(fā)生,存在自發(fā)的生精細胞凋亡,除正常精子發(fā)生過程中的生精細胞凋亡,在各種因素(激素回撤、熱刺激、電離輻射、接觸有毒物質等)刺激下也會誘導生精細胞凋亡增多,精子發(fā)生障礙。生精細胞凋亡在控制生精細胞數(shù)量上有重要作用。本文旨在探討模擬海拔5 000 m低氧環(huán)境下,C57BL/6雄性小鼠睪丸HIF-1α對生精細胞凋亡和下丘腦-腺垂體-睪丸軸激素血清睪酮(testosterone,T)、游離睪酮(free testosterone,FT)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、黃體生成素(luteinizing hormone,LH)水平的調(diào)控作用。為了深入研究低氧環(huán)境引起男性機體睪酮水平下降和精子發(fā)育異常的機制,進行了本次實驗。

1 材料與方法

1.1 建立低氧動物模型

80只SPF級18～22 g雄性C57BL/6小鼠(購自維通利華公司)隨機分為低氧3、7、14和28 d組及對應的常氧組,每組10只。低氧各組小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物室內(nèi)的低壓低氧艙(FLYDWC50-IC)中,升降速度為4～5 m/s達到模擬海拔5 000 m高度,每天除按時開艙打掃衛(wèi)生、更換食物和水約40 min外連續(xù)低氧,光照12 h,自由進食進水。常氧組飼養(yǎng)于SPF級動物室內(nèi)。

1.2 標本采集

分別于建模3、7、14和28 d后稱重,取眼球血約1 ml,頸椎脫臼處死小鼠。血樣品靜止2 h,3 500 r/min離心15 min,收集上層血清,待測血清T、FT、FSH和LH激素濃度。取小鼠雙側睪丸稱重,計算睪丸指數(shù)(睪丸指數(shù)=雙側睪丸重量/體重×100%);左側睪丸液氮保存;右側睪丸置于4%多聚甲醛中固定,石蠟包埋,制備連續(xù)切片。取小鼠右側附睪,制備精子懸液。

1.3 ELISA法檢測血清T,FT,FSH,LH濃度

用美國R&D公司小鼠睪酮(T)、游離睪酮(FT)、卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)酶聯(lián)免疫分析試劑盒,嚴格按照說明書操作檢測激素濃度。

1.4 附睪精子懸液精子計數(shù)、精子活率及精子畸形率的檢測

小鼠右側附睪,置于1 ml 37℃生理鹽水中,充分剪碎混勻,用200目濾網(wǎng)過濾,收集精子濾液。取精子濾液少許滴于載玻片上,高倍鏡下隨機鏡檢300個精子,精子活率=(運動精子數(shù)/300)×100%;取精子濾液推片做HE染色,高倍鏡下隨機鏡檢1 000個完整的精子,記錄畸形精子數(shù),精子畸形率=(畸形精子總數(shù)/1 000)×100%;取50 μ l精子濾液稀釋16倍后,用細胞計數(shù)板計數(shù)懸液中的精子數(shù)。

1.5 TUNEL法檢測睪丸生精細胞的凋亡指數(shù)(apoptosis index)

用德國Roche Applied Science公司TUNEL凋亡檢測試劑盒(In Situ Cell Death Detection Kit,POD),嚴格按照說明書操作。細胞核有明顯棕黃色著色即為陽性細胞,每組隨機計數(shù)100個生精小管中陽性細胞個數(shù)和總細胞數(shù),并計算凋亡指數(shù)(AI:每1 000個細胞中凋亡細胞的個數(shù))。

1.6 Western blot檢測睪丸HIF-1α的表達

β-actin(Subrray 公司 ,Sr25113)濃度 1∶1 000,HIF-1α(美國 Abcam,ab113642)濃度 1∶500,一抗均 4℃孵育過夜;HRP標記羊抗小鼠多克隆抗體(AbMax公司)濃度1∶4 000,室溫孵育2 h。按增強化學發(fā)光試劑(ECL)的使用說明配制發(fā)光底物工作液,顯影定影。用Image J軟件對各蛋白條帶進行灰度掃描,以內(nèi)參蛋白β-actin為基準,計算HIF-1α的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 低氧對 C57BL/6小鼠血清T、FT、FSH、LH水平的影響

與對應的常氧組相比:低氧3 d組小鼠血清T、FT、FSH和LH水平顯著升高(P＜0.05);低氧7 d組小鼠血清T、FT、FSH和LH水平無顯著變化;低氧14 d組小鼠血清T、LH水平顯著下降(P＜0.05),FT和FSH水平較常氧14 d組無明顯下降;低氧28 d組小鼠血清T、FT、FSH和LH水平均較常氧28 d組無明顯下降。與低氧3 d組相比,低氧7、14和28 d組小鼠血清T、FT、FSH和LH水平顯著降低(P＜0.05)。與低氧7 d組相比,低氧14 d組小鼠血清T顯著降低(P＜0.05)以及低氧28 d組小鼠血清LH顯著降低(P＜0.01)。與低氧14 d組相比,低氧28 d組小鼠血清FT和LH顯著升高(P＜0.05,表1)。

2.2 低氧對C57BL/6小鼠附睪精子計數(shù)、精子活率和精子畸形率的影響

與對應的常氧組相比:低氧3 d組附睪精子計數(shù)及精子活率無明顯變化,低氧7和14 d組顯著下降(P＜0.05),低氧28 d組較常氧28 d組無明顯下降;低氧各組附睪精子畸形率均顯著升高(P＜0.01)。與低氧3 d組相比,低氧7和 14 d小鼠附睪精子計數(shù)和精子活率均顯著降低(P＜0.01,表2)。低氧各組間小鼠附睪精子畸形率無顯著變化。

2.3 低氧對C57BL/6小鼠睪丸形態(tài)的影響

取材時見低氧各組睪丸外觀呈紅色充血狀(圖1見彩圖頁Ⅴ)。與對應的常氧組相比:低氧各組小鼠體重顯著減少(P＜0.05);低氧14和28 d組雙側睪丸重量顯著下降(P＜0.05);低氧3 d和7 d組睪丸指數(shù)顯著升高(P＜0.05),低氧14和28 d組睪丸指數(shù)較對應的常氧組無明顯升高。與低氧3 d組相比,低氧各組小鼠體重顯著增加(P＜0.05);低氧14和28 d組睪丸指數(shù)顯著降低(P＜0.05)。與低氧14 d組相比,低氧28 d組小鼠體重顯著增加(P＜0.05,表3)。HE染色顯示光鏡下低氧各組間質血管擴張充血,部分區(qū)域有均勻紅染的滲出液,間質水腫。低氧14 d組和28 d組生精小管出現(xiàn)生精上皮結構紊亂,管腔內(nèi)精原細胞和精母細胞數(shù)量有不同程度的減少。低氧28 d組部分區(qū)域可見生精小管萎縮,生精細胞缺失(圖2見彩圖頁Ⅴ)。

Tab.1 Comparison of C57BL/6 mice serum T,FT,FSH and LH level between hypoxia groups and normoxia groups(±s,n=10)

Tab.1 Comparison of C57BL/6 mice serum T,FT,FSH and LH level between hypoxia groups and normoxia groups(±s,n=10)

T:Testosterone;FT:Free testosterone;FSH:Follicle-stimulating hormone;LH:Luteinizing hormone;N:Normoxia group;H:Hypoxia group*P＜0.05,**P＜0.01 vs normoxia group;#P＜0.05,##P ＜0.01 vs hypoxia group of 3 d;ΔP＜0.05,Δ ΔP＜0.01 vs hypoxia group of 7 d;▲P＜0.05 vs hypoxia group of 14 d

Group T(nmol/l) FT(nmol/l) FSH(U/L) LH(pg/l)3 d N 34.40±7.93 2.73±0.73 2.93±0.72 318.9±82.1 H 51.19±10.32** 3.83±0.79* 4.01±0.88* 471.4±47.0**7 d N 32.15±11.18 2.62±1.10 2.89±0.74 289.3±44.0 H 31.78±8.49## 2.29±0.56## 3.00±0.68# 294.7±65.0##14 d N 32.48±9.58 2.27±0.72 3.13±0.65 284.3±65.0 H 25.14±3.25*##Δ 2.01±0.27## 2.82±0.51## 225.4±15.2*##Δ Δ 28 d N 31.85±10.14 2.60±0.93 3.21±0.76 317.0±63.0 H 28.61±5.04## 2.34±0.36##▲ 2.91±0.66## 279.7±76.2##▲

Tab.2 Comparison of C57/BL6 mice sperm count,motility rate and abnormal sperm rate between hypoxia groups and normoxia groups(±s,n=10)

Tab.2 Comparison of C57/BL6 mice sperm count,motility rate and abnormal sperm rate between hypoxia groups and normoxia groups(±s,n=10)

N:Normoxia group;H:Hypoxia group*P＜0.05,**P＜0.01 vs normoxia group;##P＜0.01 vs hypoxia group of 3 d

Sperm motility rate(%)Abnormal sperm rate(%)Group Sperm count(×106)3 d N 8.73±0.69 15.86±2.71 0.48±0.15 H 8.54±1.39 17.07±3.48 1.07±0.21**7 d N 7.93±2.15 16.00±4.18 0.50±0.25 H 5.60±1.33*##11.53±4.14*##1.24±0.36**14 d N 8.74±1.98 17.08±4.68 0.42±0.16 H 5.53±0.87**##11.11±2.26*##1.28±0.38**28 d N 9.12±1.48 18.38±4.88 0.46±0.13 H 7.00±1.81 14.07±5.52 1.33±0.33**

Tab.3 Comparison of C57BL/6 mice body weight and both side testis between hypoxia groups and normoxia groups(±s,n=10)

Tab.3 Comparison of C57BL/6 mice body weight and both side testis between hypoxia groups and normoxia groups(±s,n=10)

N:Normoxia group;H:Hypoxia group*P＜0.05,**P＜0.01 vs normoxia group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs hypoxia group of 3 d;△P＜0.05 vs hypoxia group of 14 d

Group Body weight(g)Testisweight(g)Testisweight/body weight(%)3 d N 22.49±1.07 0.156±0.008 0.69±0.05 H 17.63±1.01** 0.148±0.019 0.84±0.08**7 d N 22.78±2.17 0.150±0.130 0.66±0.10 H 19.98±3.11*# 0.149±0.016 0.76±0.10*14 dN 23.77±0.80 0.164±0.016 0.69±0.08 H 19.46±1.33**##0.147±0.013*0.75±0.04#28 dN 24.58±1.35 0.180±0.009 0.73±0.03 H 21.51±1.98**##△0.160±0.015*0.75±0.08#

2.4 低氧對C57BL/6小鼠睪丸生精細胞凋亡的影響

常氧組中僅有少量凋亡細胞位于生精小管基底膜附近,以精原細胞和初級精母細胞為主。與常氧組相比,低氧3 d組凋亡指數(shù)無顯著變化;低氧7、14和28 d組凋亡指數(shù)顯著升高(48.83±13.79vs84.50±12.50,114.00±19.05,71.67±12.13,P＜0.05),凋亡細胞主要是精母細胞,也有少量圓形精子細胞凋亡。與低氧3 d組相比,低氧7、14和28 d組凋亡指數(shù)顯著升高(52.83±13.29vs84.50±12.50,114.00±19.05,71.67±12.13,P＜0.05)。與低氧7 d組相比,低氧14 d組凋亡指數(shù)顯著升高(84.50±12.50vs114.00±19.05,P＜0.05)。與低氧14 d組相比,低氧28 d組凋亡指數(shù)顯著降低(114.00±19.05vs71.67±12.13,P＜0.01,圖 3,4圖3見彩圖頁Ⅴ)。

2.5 低氧對C57BL/6小鼠睪丸HIF-1α表達的影響

與常氧組相比,低氧3 d組小鼠睪丸HIF-1α的蛋白表達水平無明顯增加;低氧7、14和28 d組HIF-1α的蛋白表達水平明顯升高(1.17±0.26vs1.38±0.20,1.65±0.27,1.71±0.29,P＜0.05)。與低氧3 d組相比,低氧14和28 d組小鼠睪丸HIF-1α的蛋白表達水平顯著升高(1.23±0.16vs1.65±0.27,1.71±0.29,P＜0.05,圖5)。

Fig.4 Apoptosis index of C57BL/6 mice testis after induction of hypoxia(±s,n=10)

Fig.5 HIF-1αprotein expression level of C57BL/6mice testis after induction of hypoxia

2.6 性激素水平、精子各項參數(shù)、凋亡指數(shù)AI及HIF-1α表達之間的相關性分析

低氧3 d組HIF-1α的表達與T呈負相關(r=-0.999,P=0.035),其余指標之間無顯著相關;低氧7 d組各指標之間無顯著相關;低氧14 d組精子畸形率與AI呈正相關(r=0.933,P=0.007),其余指標之間無顯著相關;低氧28 d組HIF-1α的表達與AI呈正相關(r=0.791,P=0.042),FT與精子活率呈正相關(r=0.680,P=0.044),其余指標之間無顯著相關。

3 討論

本研究采用低壓氧艙模擬海拔5 000 m高原低氧環(huán)境,動態(tài)研究低氧對C57BL/6小鼠血清下丘腦-腺垂體-睪丸軸激素水平的影響。機體在高海拔急性低氧時睪酮增加,促進紅細胞生成,血紅蛋白增多提高氧的運輸能力,與機體在高海拔地區(qū)習服與適應的過程緊密聯(lián)系[4]。低氧3 d時,下丘腦-腺垂體-睪丸軸激素T、FT、FSH和LH釋放增多,即急性低氧時小鼠呈應激狀態(tài),可能與機體有效適應急性低氧環(huán)境有關。隨低氧時間延長機體持續(xù)高水平的睪酮會導致紅細胞持續(xù)增多,降低動脈血氧飽和度,呼吸效率低下,降低通氣量,最終導致慢性高原病,所以高水平的睪酮對于高海拔低氧的適應是不利的[4]。本研究顯示隨著低氧時間延長至14 d時小鼠下丘腦-腺垂體-睪丸軸激素水平都不同程度地降低,與機體有效適應高海拔低氧有關。國內(nèi)也有研究表明模擬海拔5 000 m高原低氧30 d可抑制成年Wistar大鼠睪酮的分泌[5];模擬海拔3 000和5 000 m高原低氧14 d可抑制成年SD大鼠睪酮的分泌[6]。盡管如此,本研究低氧28 d組小鼠血清FT與精子活率呈正相關,表明慢性低氧時機體低水平的FT可導致精子活率下降,進而影響生殖功能。

低氧環(huán)境下機體低水平的性激素必然會影響睪丸的形態(tài)與功能。睪丸間質Leydig細胞分泌T后一部分入血,作用于遠方的靶組織,參與對性行為的調(diào)節(jié)和雄性第二性征的維持;睪丸組織內(nèi)的T作用于生精上皮,參與對精子發(fā)生的調(diào)節(jié)。在成年期,FSH和T協(xié)同作用于精原細胞,并維持生成精子的數(shù)量和質量,精子的發(fā)生主要受FSH和T這兩個激素的調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)低氧小鼠睪丸生精細胞凋亡增多,表明低氧環(huán)境下機體低水平的T和FSH可能參與了生精細胞的凋亡,影響了精子的生成。國內(nèi)也有研究表明:低氧誘導成年Wistar大鼠睪丸生精細胞凋亡增多,慢性低氧(低氧30 d)引起的睪丸生精細胞凋亡增多與凋亡促進蛋白Bax表達增加有關[7]。

國外研究表明動物睪丸的微環(huán)境是相對低氧的,依據(jù)是(1)精子發(fā)生過程所需的氧耗量高,(2)睪丸組織增加血流量的調(diào)控能力較低,(3)睪丸中的氧分壓相對較低[8,9]。低氧環(huán)境可進一步加重小鼠睪丸缺氧,正如本研究所示低氧各組小鼠睪丸肉眼觀呈紅色充血狀,低氧各組睪丸指數(shù)不同程度增加,說明睪丸組織有不同程度的水腫;HE染色顯示間質血管擴張充血,部分區(qū)域有均勻紅染的滲出液,間質水腫。

低氧誘導因子-1(HIF-1)是由120 kD α亞單位和91-94kDβ亞單位組成的轉錄因子,作為組織缺氧的重要標志,可以上調(diào)細胞存活、生長、分化、及凋亡等基因的表達,以維持組織和細胞在缺氧條件下內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,以適應缺氧。HIF-1α作為低氧應激蛋白,在組織低氧時表達增加。相關性分析表明低氧3 d組HIF-1α的表達與T呈負相關;隨著低氧時間的延長HIF-1α表達逐漸增加,并維持在高水平狀態(tài),與低氧組小鼠睪丸生精細胞凋亡增多一致,表明低氧組小鼠睪丸HIF-1α的高表達可能也參與了生精細胞的凋亡,低氧28 d組HIF-1α的表達與AI呈正相關。在研究精索靜脈曲張的大鼠模型中,睪丸血流瘀滯,組織發(fā)生變性,睪丸處于低氧狀態(tài),并且睪丸高表達HIF-1α,生精細胞凋亡增加,二者之間呈正相關[10]。上述均可以說明HIF-1α在睪丸組織低氧應激情況下,可能參與了生精細胞的凋亡。因此進一步的研究將會圍繞HIF-1α在低氧環(huán)境下影響生精細胞凋亡的機制來展開。

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