鄭茂東，顏娟，王愛萍，趙秀花，張鶴鳴

(河北北方學院附屬第一醫(yī)院，河北張家口 075000)

?

三價鐵對燈盞花素與溶菌酶相互作用的影響

鄭茂東，顏娟，王愛萍，趙秀花，張鶴鳴

(河北北方學院附屬第一醫(yī)院，河北張家口 075000)

摘要：目的探討三價鐵(Fe3+)在模擬人體正常生理環(huán)境下對溶菌酶與燈盞花素相互作用的影響。方法運用同步熒光光譜法觀察有無Fe3+參與時燈盞花素與溶菌酶的相互作用。結(jié)果有、無Fe3+存在，燈盞花素與溶菌酶均可形成基態(tài)復合物從而猝滅溶菌酶的內(nèi)源性熒光，猝滅原因均為靜態(tài)猝滅。有、無Fe3+存在，熱力學溫度為308 K時燈盞花素與溶菌酶的結(jié)合常數(shù)分別為1.15×106、1.08×106L/mol，結(jié)合位點數(shù)分別為0.993、1.19。在Fe3+存在時，燈盞花素與溶菌酶作用力由疏水作用改變?yōu)榉兜氯A力和氫鍵，結(jié)合位點靠近色氨酸，并使色氨酸的疏水性增強。結(jié)論Fe3+不改變燈盞花素與溶菌酶的猝滅作用機制，但使得兩者結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)和作用力類型發(fā)生改變。

關鍵詞：Fe3+；燈盞花素；溶菌酶；熒光光譜法；同步熒光法

溶菌酶是小分子堿性蛋白，普遍存在生物機體內(nèi)，能與大量外源性和內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合。研究溶菌酶有利于從微觀水平上探討藥物在生物體內(nèi)的藥理作用、代謝轉(zhuǎn)化過程和不良反應，為臨床合理用藥提供參考[1~4]。燈盞花素是從中藥燈盞花中提取的黃酮類成分，其主要有效成分為燈盞乙素，是一種黃酮苷類化合物，具有擴張腦血管、增加腦血流量等作用[5]。鐵在生命體系中是常見的微量金屬元素，其參與的生物過程包括NDA合成、呼吸作用、能量轉(zhuǎn)換、氧的運輸?shù)取?014年6月～2015年1月，我們觀察人體內(nèi)微量金屬元素鐵(Fe3+)對燈盞花素與溶菌酶作用的影響，進而了解燈盞花素在人體內(nèi)的吸收、分布、代謝以及其藥理作用機制。

1材料與方法

1.1儀器和試劑 熒光分光光度計(美國 Varian 公司，附帶Peltier 電子恒溫裝置)；電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；可調(diào)節(jié)加樣器(芬蘭 Biohit 公司)；pHS-3C 型精密 pH 計(上海雷磁儀器廠)；溶菌酶(美國sigma 公司，用緩沖溶液配制濃度為1.06×10-4mol/L)；燈盞花素(昆明龍津藥業(yè)股份有限公司，批號：20140512-1，用緩沖溶液配制濃度為1.10×10-4mol/L)；Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液(濃度為0.02 mol/L，pH 7.40，內(nèi)含0.15 mol/L的NaCl)；FeCl3為分析純；實驗用水為二次蒸餾水。

2結(jié)果

2.1燈盞花素、燈盞花素-Fe3+與溶菌酶相互作用隨著燈盞花素濃度的增加，溶菌酶的熒光強度逐漸降低，同時最大發(fā)射波長藍移3~5 nm。加入Fe3+前后溶菌酶的峰形和峰位沒有發(fā)生明顯變化，但是猝滅程度明顯增大。見圖1。表明燈盞花素與溶菌酶發(fā)生結(jié)合作用，F(xiàn)e3+對其相互作用有一定影響。

注：A 燈盞花素與溶菌酶相互作用　　B燈盞花素-Fe3+與溶菌酶相互作用

2.2燈盞花素、燈盞花素-Fe3+與溶菌酶作用相關參數(shù)變化KSV隨著溫度的升高而減小，KLB隨著溫度的升高而增大，說明燈盞花素對溶菌酶的猝滅過程是由于兩者形成不發(fā)光的復合物而引起的靜態(tài)猝滅。Fe3+存在時，燈盞花素對溶菌酶的猝滅程度有所增加，但猝滅類型未發(fā)生改變，仍為靜態(tài)猝滅。Fe3+存在時，燈盞花素與溶菌酶的結(jié)合常數(shù)K增大，表明Fe3+參與加強了燈盞花素與溶菌酶的作用，但是結(jié)合位點數(shù)近似等于1。熱力學參數(shù)△rHm>0，△rSm>0，可判定燈盞花素與溶菌酶作用力為典型的疏水作用。Fe3+存在下，△rHm<0，△rSm<0，推測燈盞花素與溶菌酶的作用力類型改變以氫鍵和范德華力為主。見表1。

2.3燈盞花素、燈盞花素-Fe3+對溶菌酶構(gòu)象的影響溶菌酶中色氨酸和酪氨酸殘基的熒光強度均有規(guī)律減弱，色氨酸殘基的熒光強度降低更加明顯，說明溶菌酶的熒光主要是色氨酸殘基，推測燈盞花素與溶菌酶的結(jié)合位點更接近于色氨酸殘基。色氨酸的最大發(fā)射波長發(fā)生藍移，表明燈盞花素的加入使色氨酸殘基附近的極性減弱，疏水環(huán)境增強，肽鏈的伸展程度減小[12]。Fe3+存在下，酪氨酸和色氨酸殘基的熒光猝滅程度增加，峰形和峰位發(fā)生改變，說明Fe3+參與了燈盞花素與溶菌酶的作用過程，但未改變色氨酸殘基附近的環(huán)境。

表1　燈盞花素、燈盞花素-Fe3+與溶菌酶作用的相關參數(shù)

3討論

溶菌酶又稱為N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶或胞壁質(zhì)酶，研究蛋白的空間構(gòu)象、酶動力學、分子進化與分子免疫間的關系時，溶菌酶作為模型體系可提供載體。另外，溶菌酶也是血漿中重要選擇性載體蛋白，能夠與許多內(nèi)、外源性物質(zhì)結(jié)合，進而發(fā)揮其生物功能。同時，溶菌酶是臨床應用的有效抗菌消炎劑，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等致病菌有抑殺作用，具有抗病毒作用，參與機體多種免疫反應。人體溶菌酶的濃度可用于診斷多種疾病，如再生障礙性貧血和急性白血癥的診斷指標之一是血清溶菌酶的水平低于正常值。通過測定尿液和體內(nèi)的溶菌酶水平，可以判斷腎小管功能障礙性疾病和燒傷患者的病情嚴重程度。溶菌酶作為一種天然蛋白質(zhì)，在醫(yī)學方面應用前景廣闊[1~4]。

大量研究顯示，燈盞花素具有擴張腦血管、增加腦血流量等作用，深入研究燈盞花素在體內(nèi)的藥效、不良反應及作用機制有重要的臨床意義。探討燈盞花素與溶菌酶的相互作用，有利于從分子水平上闡明燈盞花素在體內(nèi)的作用機制，了解燈盞花素發(fā)揮藥效的作用機理，也是當前生命科學、醫(yī)學領域的研究熱點。另外，人體是一個復雜的體系，人體內(nèi)存在多種金屬離子，能與藥物或酶蛋白結(jié)合發(fā)揮獨特作用。本文利用同步熒光光譜法模擬正常人體生理環(huán)境下Fe3+對溶菌酶、燈盞花素的相互作用及影響，將燈盞花素-溶菌酶二元體系拓展至燈盞花素-金屬離子-溶菌酶三元體系加以研究，得到更加豐富的理論數(shù)據(jù)。表明Fe3+雖然不改變燈盞花素與溶菌酶的猝滅作用機制，但使得兩者結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)和作用力類型發(fā)生改變。Fe3+存在時，燈盞花素與溶菌酶的結(jié)合常數(shù)增大，表明Fe3+參與并加強了燈盞花素與溶菌酶的作用。從藥學和臨床醫(yī)學兩個角度考慮，由于Fe3+的存在，燈盞花素在血漿中釋放更緩慢，貯留時間延長，有利于延長燈盞花素在體內(nèi)的作用時間，使其藥效更持久。說明復雜的生命體系中金屬離子對物質(zhì)的代謝、轉(zhuǎn)運有獨特作用。

參考文獻：

[1] 張紅艷.阿昔洛韋片、溶菌酶腸溶片、小兒雙金清熱口服液聯(lián)合治療小兒皰疹性口腔炎療效觀察[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2014,23(17):1875-1877.

[2] 席鵬程,時開網(wǎng),朱響,等.胰腺癌組織中血管內(nèi)皮生長因子和尿激酶型血纖維蛋白溶菌酶原活化劑基因表達與血管生成的關系及臨床意義[J].中國腫瘤臨床與康復,2014,21(10):1174-1177.

[3] 孫翠娥,唐曉文,孫愛寧,等.粒細胞肉瘤9例臨床分析及文獻復習[J].上海交通大學學報(醫(yī)學版),2013,33(9):1231-1234.

[4] Zhang HM, Xu YQ, Zhou QH, et al. Investigation of the interaction between chlorophenols and lysozyme in solution[J]. J Photochemi Photobiol B, 2011,104(3):405-413.

[5] 鐘海軍,鄧英杰,徐春蓮,等.燈盞花素的理化性質(zhì)研究[J].中國藥房,2013,24(7):608-610.

[6] 楊頻,高飛.生物無機化學原理[M].北京:科學出版社,2002:322.

[7] 楊曼曼,楊頻,張立偉.熒光法研究咖啡酸類藥物與白蛋白的作用[J].科學通報,1994,39(1):31-35.

[8] 賈昊迪,王建明,劉憲英,等.綠原酸與牛血清白蛋白的相互作用及酒精對其的影響[J].時珍國醫(yī)國藥,2011,22(6):1335-1337.

[9] 鄭茂東,楊錦艷,郝娟,等.中藥成分五味子甲素及其金屬離子復合物與血清白蛋白相互作用的研究[J].分析科學學報,2010,26(4):400-404.

[10] Ross PD, Subramanian S. Thermodynamics of protein association reactions: forces contributing to stability[J]. Biochemistry, 1981, 20(11): 3096-3102.

[11] 董露,易忠勝,伍智蔚,等.2'-羥基-2,4-二溴二苯醚與人血清白蛋白作用機制的光譜研究與計算模擬[J].高等學校化學學報,2015,29(3):516-522.

[12] 張曉靜,許多多,張俊義,等.膽酸類化合物與牛血清白蛋白相互作用的光譜學研究[J].中國實驗方劑學雜志,2014,20(1):56-62.

(收稿日期：2015-10-09)

中圖分類號：R969

文獻標志碼：B

文章編號：1002-266X(2016)05-0079-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.05.033

基金項目：河北省醫(yī)學科學研究重點課題計劃項目(ZD20140167)；張家口市科技局科技計劃項目(1421132D)。