馮迎軍

(鄭州市兒童醫(yī)院，鄭州450000)

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先天性心臟病合并肺動脈高壓患者的心肌纖維化評價

馮迎軍

(鄭州市兒童醫(yī)院，鄭州450000)

摘要：目的探討先天性心臟病合并肺動脈高壓患者的心肌纖維化情況。方法選擇先天性心臟病患兒64例，其中未合并肺動脈高壓32例(A組)，合并肺動脈高壓32例(B組)。采用RT-PCR法檢測心肌組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1) mRNA表達。結(jié)果A組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原mRNA的相對表達量分別為1.95±0.34、1.19±0.37，B組分別為2.95±0.21、1.88±0.54；A組CTGF、TGF-β1mRNA的相對表達量分別為0.80±0.27、0.44±0.20，B組分別為1.31±0.50、0.89±0.48；B組心肌組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、CTGF、TGF-β1mRNA表達均高于A組(P均<0.05)。CTGF表達與Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達呈正相關(guān)(r分別為0.427、0.513，P均<0.05)；TGF-β1表達與Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達呈正相關(guān)(r分別為0.471、0.504，P均<0.05)。結(jié)論先天性心臟病合并肺動脈高壓患者心肌纖維化程度升高，檢測心肌組織CTGF、TGF-β1表達可評估心肌纖維化程度。

關(guān)鍵詞：先天性心臟病；肺動脈高壓；心肌纖維化；結(jié)締組織生長因；轉(zhuǎn)化生長因子-β1

肺動脈高壓是各種原因引起的靜息狀態(tài)下右心導(dǎo)管測得的肺動脈平均壓≥25 mmHg的一組臨床病理生理綜合征[1]。結(jié)締組織生長因子(CTGF)是一種富含半胱氨酸的分泌肽，與血管、皮膚、心臟、腎臟、胰腺、肺及肝臟等在內(nèi)的許多組織器官纖維化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是一種多功能蛋白質(zhì)，可以影響多種細胞的生長，分化、細胞凋亡及免疫調(diào)節(jié)等功能[3]。本研究檢測先天性心臟病合并肺動脈高壓患者心肌組織CTGF、TGF-β1表達情況，并探討其與心肌纖維化程度的關(guān)系。

1資料與方法

1.1臨床資料2013年8月~2015年6月本院收治先天性心臟病患兒64例，均經(jīng)體檢、超聲心動圖檢查確診，并排除其他合并心臟畸形、心力衰竭、需行手術(shù)治療的瓣膜病變以及術(shù)前服用過鈣離子拮抗劑、β受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑者。其中未合并肺動脈高壓32例(A組)，男17例、女15例，年齡2~12(7.0±2.6)歲，體質(zhì)量12~45(29.61±8.15)kg；孔型房間隔缺損(ASD)15例、室間隔缺損(VSD)10例、動脈導(dǎo)管未閉(PDA)7例。合并肺動脈高壓32例(B組)，男18例、女14例，年齡2~11(7.2±2.4)歲，體質(zhì)量10~43(29.04±8.20)kg；孔型ASD 16例、VSD 10例、PDA 6例。兩組性別構(gòu)成、年齡、體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

1.2心肌標(biāo)本采集患兒入院后于心外科體外循環(huán)開始后、插入上腔靜脈引流管前，切取右心耳心肌組織，放入冰凍生理鹽水中，去掉血液及脂肪后吸干水分，置于液氮中保存，后移至-70 ℃冰箱中保存，待檢。

1.3心肌組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、CTGF、TGF-β1表達檢測

1.3.1提取總RNA取心肌組織加入液氮研磨成粉末狀，加入1 mL Trizal試劑，放置10 min；將溶劑轉(zhuǎn)移至無酶EP管，于4 ℃、12 000 r/min離心10 min；將上清液移至無酶EP管，加200 μL氯仿，振蕩、混勻，冰上孵育15 min，于4 ℃、12 000 r/min離心15 min；取最上層無色水相置無酶EP管，加500 μL冰浴異丙醇，顛倒振蕩、混勻，冰浴中靜置10 min，于4 ℃、12 000 r/min離心10 min；棄上清液，用1 mL冰浴的75%乙醇洗滌RNA沉淀，于4 ℃、12 000 r/min離心5 min,重復(fù)2次；棄掉上清液，晾干RNA；30 mL DEPC處理水溶解RNA；取2 μL RNA用紫外分光光度計確定其純度和濃度，取5 μL RNA通過瓊脂糖凝膠電泳分析其完整性。

1.3.2逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴增總RNR逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。將0.2 mL無RNA酶PCR管置冰上，加入2×PCR Master Mix 12.5 μL，F(xiàn)orward Primer 0.5 μL，Reverse Primer 0.5 μL，Template DNA 0.5 μL，Water muclease-free 11 μL。Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、CTGF、TGF-β1引物由上海生物工程有限公司合成，擴增條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min、94 ℃變性 30 s、60 ℃復(fù)性40 s、60 ℃延伸40 s、94 ℃ 最后延伸5 min，重復(fù)35個循環(huán)，產(chǎn)物于4 ℃保存。

1.3.3mRNA表達檢測取PCR產(chǎn)物10 μL，2.0%瓊脂糖凝膠于120 V電壓下電泳30 min后采用凝膠成像系統(tǒng)觀察，采用Quantity one軟件讀取灰度值，用比值作為Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、CTGF、TGF-β1mRNA的表達水平，結(jié)果做半定量分析。

2結(jié)果

2.1兩組心肌組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原mRNA表達兩組于216、 347、376 bp處見擴增產(chǎn)物條帶，分別為β-actin、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的編碼基因片段。B組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原mRNA相對表達量高于A組(P均<0.05)。見表1。

表1　兩組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原mRNA表達比較

2.2兩組心肌組織中CTGF、TGF-β1mRNA表達兩組于216、 477、186 bp處見擴增產(chǎn)物條帶，分別為β-actin、CTGF、TGF-β1的編碼基因片段。B組CTGF、TGF-β1mRNA相對表達量高于A組(P均<0.05)。見表2。

表2　兩組CTGF、TGF-β1 mRNA表達比較

2.3CTGF、TGF-β1表達與Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達的關(guān)系 經(jīng)直線相關(guān)分析顯示，CTGF表達與Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原呈正相關(guān)(r分別為0.427、0.513，P均<0.05)；TGF-β1表達與Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原呈正相關(guān)(r分別為0.471、0.504，P均<0.05)。

3討論

肺動脈高壓是先天性心臟病常見并發(fā)癥，也是是心血管外科最嚴重的并發(fā)癥之一[4，5]。如果能早期診斷及時治療，可以使20%的患者病情穩(wěn)定，甚至痊愈。觀察先天性心臟病合并肺動脈高壓患者的心肌纖維化情況，可對其病情嚴重程度進行評價，對臨床診治有一定指導(dǎo)意義。心肌纖維化是由中重度的冠狀動脈粥樣硬化性狹窄引起心肌纖維持續(xù)性和(或)反復(fù)加重的心肌缺血缺氧所產(chǎn)生的結(jié)果，心臟體積增大，質(zhì)量增加，心腔擴張；心壁厚度可能正常，伴有多灶性白色纖維條索或條塊，甚至透壁性瘢痕；心內(nèi)膜增厚并失去正常光澤，有時可見機化的附壁性血栓。光鏡下可見廣泛性、多灶性心肌纖維化，伴鄰近心肌纖維萎縮和(或)肥大，常有部分心肌纖維肌質(zhì)空泡化，尤以內(nèi)膜下區(qū)明顯。臨床上可表現(xiàn)為心律失?；蛐牧λソ遊6]。心肌纖維化主要表現(xiàn)為心肌各種膠原比例失調(diào)，Ⅰ型、Ⅲ型膠原合成與降解的平衡破壞，使心肌間質(zhì)及血管周圍Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維過度沉積，導(dǎo)致心肌代謝異常、僵硬度增高、舒縮功能障礙[7]。本研究中，B組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原mRNA的相對表達量高于A組，提示先天性心臟病合并肺動脈高壓患者存在心肌纖維化。

CTGF所在家族成員在氨基酸序列上有著高度的同源性，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中包括N末端的胰島素樣生長因子結(jié)合區(qū)、血管性假血友病因子C型重復(fù)區(qū)、血小板反應(yīng)蛋白1型重復(fù)區(qū)以及富含半胱氨酸的C末端結(jié)合區(qū)四個主要結(jié)構(gòu)區(qū)域[8]。熱娜·艾山等[9]研究認為，超聲背向散射測定結(jié)合CTGF、Ⅰ型前膠原氨基端肽可顯示持續(xù)性房顫患者的心房肌纖維化程度。李勇等[10]對急性ST段抬高型心肌梗死患者血清CTGF表達進行檢測，結(jié)果顯示心肌梗死組患者發(fā)病后各時間段血清CTGF蛋白濃度較心絞痛組高。心肌梗死組患者發(fā)病后血清CTGF蛋白濃度第1~7天逐漸升高，第7天時血清CTGF蛋白濃度與CK-MB酶活性峰值呈正相關(guān)。認為CTGF濃度對預(yù)測心肌梗死面積有一定的臨床意義。本研究中B組CTGF mRNA的相對表達量高于A組，進一步證實先天性心臟病合并肺動脈高壓患者存在心肌纖維化。

近年來發(fā)現(xiàn)，TGF-β對細胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用。一般來說，TGF-β對間充質(zhì)起源的細胞起刺激作用，而對上皮或神經(jīng)外胚層來源的細胞起抑制作用[11]。TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3功能相似。韓秀霞等[12]研究顯示，慢性腎臟病患者血清TGF-β1水平高于正常健康人，且血清TGF-β1與室間隔厚度、左室后壁厚度、左室質(zhì)量均呈正相關(guān)，與左室射血分數(shù)、 左室短軸縮短率、 心臟指數(shù)均呈負相關(guān)，可見血清TGF-β1水平可反映心肌肥厚情況及心功能水平。馬洪亮等[13]研究顯示，先天性心臟病伴重度肺動脈高壓患兒血清VEGF及TGF-β1濃度高于輕度肺動脈高壓和無肺動脈高壓患兒，肺動脈收縮壓與血清VEGF及TGF-β1水平呈正相關(guān)。提示VEGF和TGF-β1水平對預(yù)測肺動脈高壓發(fā)生、發(fā)展的動態(tài)變化有一定臨床價值。本研究B組CTGF、TGF-β1mRNA的相對表達量顯著高于A組，提示先天性心臟病合并肺動脈高壓患者心肌纖維化程度高于未合并肺動脈高壓患者。直線相關(guān)分析顯示，CTGF、 TGF-β1表達水平與Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達均呈正相關(guān)關(guān)系，表明對心肌組織中CTGF、TGF-β1水平進行檢測可評估心肌纖維化程度。

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(收稿日期：2015-09-04)

中圖分類號：R541.1

文獻標(biāo)志碼：B

文章編號：1002-266X(2016)05-0032-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.05.012