丁鳳霞，朱仲玲，閻昭

(天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院·國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心·天津市腫瘤防治重點實驗室，天津 300060)

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替莫唑胺耐藥細(xì)胞系SHG-44/TR生物學(xué)特征及其耐藥機制

丁鳳霞，朱仲玲，閻昭

(天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院·國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心·天津市腫瘤防治重點實驗室，天津 300060)

摘要：目的探討對替莫唑胺耐藥的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG-44/TR的生物學(xué)特征及耐藥機制。方法通過體外分階段劑量遞增誘導(dǎo)法使人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG-44對替莫唑胺產(chǎn)生耐藥性，建立耐藥細(xì)胞系SHG-44/TR。采用細(xì)胞集落形成試驗和噻唑藍比色法檢測SHG-44/TR增殖情況、耐藥性及耐藥指數(shù)；采用 Western -blotting法檢測耐藥蛋白O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)及人類錯配修復(fù)蛋白2(hMSH2)表達變化；流式細(xì)胞儀檢測SHG-44/TR細(xì)胞周期變化。結(jié)果歷時8個月成功建立了對替莫唑胺耐藥的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞 SHG-44 /TR。與SHG-44比較，SHG-44/TR對替莫唑胺的耐受程度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SHG-44/TR沒有細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象；SHG-44/TR較親本細(xì)胞MGMT蛋白表達無變化，hMSH2表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG-44/TR hMSH2表達降低,其耐藥機制可能為DNA錯配修復(fù)缺失。

關(guān)鍵詞：替莫唑胺；耐藥機制；腦膠質(zhì)瘤；錯配修復(fù)；O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是惡性程度較高且最為常見的腦腫瘤[1]。臨床上以手術(shù)治療為主、替莫唑胺化療聯(lián)合放療為輔的治療方案在延長膠質(zhì)瘤患者生存期方面起了很大作用[2，3]。但是，膠質(zhì)瘤患者預(yù)后仍然不理想，繼發(fā)性耐藥的出現(xiàn)是臨床替莫唑胺化療失敗的主要原因；耐藥機制包括O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 ( MGMT)的過表達和DNA錯配修復(fù)(MMR)的缺失以及堿基切除修復(fù)等[4]。2014年4～12月，本文采用替莫唑胺為誘導(dǎo)劑，通過濃度梯度遞增誘導(dǎo)法建立對替莫唑胺耐藥的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，并探討其在MMR方面的耐藥機制。

1材料與方法

1.1材料人惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SHG-44、替莫唑胺由天津天士力有限公司提供；改良型培養(yǎng)基(DMEM)、胰蛋白酶、胎牛血清購自Gibico公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)、青霉素、鏈霉素均購自Sigma公司；兔抗人單克隆抗體MGMT、兔抗人單克隆抗體MSH2、鼠抗人單克隆抗體β-actin抗體均購自CST公司；抗體工作濃度均為1∶ 1 000；SDS裂解液購自碧云天生物技術(shù)公司。另有CO2培養(yǎng)箱、流式細(xì)胞儀、酶標(biāo)儀、熒光倒置顯微鏡等。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及耐藥細(xì)胞系SHG-44/TR的建立SHG-44細(xì)胞置于體積分?jǐn)?shù)為10% 胎牛血清、青霉素100 IU/mL和鏈霉素100 μg/mL的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2和一定濕度的條件下孵育培養(yǎng)，每2 d更換培養(yǎng)液1次，當(dāng)細(xì)胞增殖至80%時用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。將處于對數(shù)生長區(qū)的SHG-44細(xì)胞制成1×105/mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后加入初始誘導(dǎo)濃度的替莫唑胺(1 μmol/L)[5]，繼續(xù)培養(yǎng)15 d，然后將藥物濃度倍增。當(dāng)替莫唑胺倍增至16 μmol/L時，每次將濃度提高16 μmol/L至終濃度200 μmol/L，每個濃度都穩(wěn)定培養(yǎng)15 d，歷時8個月建成SHG-44耐藥細(xì)胞系，命名為SHG-44/TR。

1.3細(xì)胞形態(tài)觀察及MTT法繪制生長曲線將SHG-44和SHG-44/TR分別傳代，穩(wěn)定培養(yǎng)2 d，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并用熒光倒置顯微鏡拍照。取對數(shù)生長期的SHG-44和SHG-44/TR細(xì)胞消化計數(shù)，制成1×104/mL細(xì)胞懸液以每孔100 μL鋪于96孔板中，每種細(xì)胞每個時間段設(shè)3個復(fù)孔，每24 h在酶標(biāo)儀490 nm處檢測OD值，連續(xù)檢測7 d。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4SHG-44/TR耐藥指數(shù)檢測將處于對數(shù)生長期的SHG-44/TR和SHG-44以2×104/mL分別鋪于96孔板中，每孔100 μL，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，過夜培養(yǎng)后加入含替莫唑胺藥物培養(yǎng)基100 μL，使終濃度分別為62.5、125、250、500、1 000 μmol/L，并設(shè)空白對照組和調(diào)零孔。37 ℃ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)96 h后，每孔加入20 μL 濃度為5 mg/mL的MTT，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，4 h后小心吸出孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，使藍紫色甲瓚結(jié)晶溶解，酶標(biāo)儀檢測490 nm處的各孔光吸收值(OD值)。計算SHG-44和SHG-44/TR的半數(shù)抑制率(IC50)和耐藥指數(shù)。

1.5替莫唑胺對SHG-44和SHG-44/TR的抑制情況檢測取對數(shù)生長期SHG-44、SHG-44/TR細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為4×102/mL，以每孔1 mL接種于12孔板中，貼壁后，各實驗組加入含藥培養(yǎng)液1 mL(濃度分別為0、25、50、100、200、300、400、500 μmol/L)，每組設(shè)2個復(fù)孔。每隔3 d換1次液，2周后取出培養(yǎng)板，甲醇固定10 min，加入結(jié)晶紫染色液染色30 min。顯微鏡下觀察克隆大小及數(shù)量。

1.6細(xì)胞周期檢測消化收集SHG-44、SHG-44/TR以及加替莫唑胺處理的細(xì)胞，室溫下1 000 r/min離心5min，預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入2 mL 75%預(yù)冷冰乙醇，-20 ℃冰箱內(nèi)固定過夜。第2天將固定好的細(xì)胞取出1 000 r/min離心5 min，棄冰乙醇，預(yù)冷PBS重懸清洗細(xì)胞再1 000 r/min離心5 min。每管加入RnaseA、Triton-X和PI混合液100 μL，室溫避光孵育20 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，使用Cellquest軟件采集樣本，用WinMDI2.9軟件行細(xì)胞周期分析。

1.7耐藥相關(guān)蛋白表達情況檢測SDS裂解液裂解SHG-44、SHG-44/TR，提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，上樣40 μg，15%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜封閉1 h，4 ℃孵育MGMT。加入人類錯配修復(fù)蛋白2(hMSH2)單克隆抗體(一抗)過夜，熒光二抗室溫孵育1 h，熒光掃描儀掃描。

2 結(jié)果

2.1SHG-44與SHG-44/TR形態(tài)學(xué)變化SHG-44腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系為成纖維狀細(xì)胞，梭形并呈現(xiàn)多觸角，排列緊密，大小均勻，邊界清晰；而替莫唑胺誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞系SHG-44/TR則形態(tài)不規(guī)則，觸角減少，偶有細(xì)胞形態(tài)變圓，形態(tài)變大，排列松散，大小不均勻。

2.2SHG-44與SHG-44/TR細(xì)胞系倍增時間比較耐藥細(xì)胞系SHG-44/TR比SHG-44生長速度明顯減慢。見圖1。

圖1　SHG-44和SHG-44/TR細(xì)胞生長曲線

2.3SHG-44/TR細(xì)胞株耐藥指數(shù)SHG-44細(xì)胞系IC50值為(264±23.99)μmol/L， SHG-44/TR細(xì)胞IC50值為(1 684±32.17)μmol/L，SHG-44/TR對SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥指數(shù)[IC50(SHG-44/TR)/IC50(SHG-44) ]約為6，二者對替莫唑胺的耐受程度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4替莫唑胺對SHG-44、SHG-44/TR細(xì)胞克隆形成的抑制作用替莫唑胺對SHG-44/TR細(xì)胞克隆形成抑制作用明顯低于SHG-44細(xì)胞。在替莫唑胺濃度200 μmol/L以上時，SHG-44沒有克隆形成，而SHG-44/TR細(xì)胞存活率在70%以上，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

圖2　不同替莫唑胺濃度對SHG-44和

2.5SHG-44/TR相對SHG-44細(xì)胞周期的變化SHG-44細(xì)胞對照組和SHG-44加入100 μmol/L 替莫唑胺組G1期細(xì)胞分別為 (50.73±5.74)%和(38.11±4.28)%，G2期細(xì)胞分別為(8.28±1.26)%和(20.2±2.11)%，S期細(xì)胞分別為(40.99±3.21)%和(41.74±2.79)%；SHG-44細(xì)胞加藥組相對對照組細(xì)胞周期停滯在G2期，且G1期減少，S期基本不變。SHG-44/TR細(xì)胞對照組和SHG-44/TR加入100 μmol/L 替莫唑胺組G1期細(xì)胞分別為(49.97±5.23)%和(43.73±3.89)%，G2期細(xì)胞分別為(14.76±1.54)%和(16.11±1.22)%，S期細(xì)胞分別為(35.12±2.98)%和(40.17±3.12)%；兩組細(xì)胞各個周期變化均不大，細(xì)胞周期沒有停滯現(xiàn)象出現(xiàn)。

2.6SHG-44/TR耐藥相關(guān)蛋白表達水平變化SHG-44、SHG-44/TR膠質(zhì)瘤細(xì)胞均不表達MGMT；SHG-44高表達hMSH2，SHG-44/TR細(xì)胞內(nèi)hMSH2表達量較SHG-44明顯降低(P<0.05)。

3討論

作為第二代烷化劑替莫唑胺是治療膠質(zhì)瘤的首選藥，然而膠質(zhì)瘤對其耐藥卻經(jīng)常發(fā)生。本文采用替莫唑胺濃度從低到高的方法經(jīng)8個月成功誘導(dǎo)成SHG-44耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG-44/TR。MTT法檢測發(fā)現(xiàn)SHG-44/TR相對親本細(xì)胞系生長速度明顯減慢，耐藥指數(shù)為6；而且SHG-44/TR細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞變大，消耗能量增加，增殖能力變慢。對于MGMT高表達的細(xì)胞系，降低MGMT表達是克服耐藥的主要方法[6]。本文MGMT在SHG-44和SHG-44/TR中都沒有表現(xiàn)出高表達[7]，因此SHG-44/TR所產(chǎn)生的耐藥性并非MGMT的高表達產(chǎn)生。MGMT低表達或不表達的耐藥細(xì)胞系中，MMR缺失將代替MGMT高表達產(chǎn)生耐藥，于是本研究檢測了MMR相關(guān)蛋白hMSH2。結(jié)果顯示，耐藥細(xì)胞系較親本細(xì)胞hMSH2蛋白明顯降低。盡管沒有觀察MGMT表達變化，但是hMSH2蛋白表達下調(diào)使膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44產(chǎn)生了耐藥性。

MMR是一個修復(fù)DNA合成過程中產(chǎn)生的核苷酸堿基錯配的系統(tǒng)[8]。當(dāng)MGMT不存在時，O6-MG可以與胸腺嘧啶配對；在MMR高表達的細(xì)胞中O6-MEG-T錯配由一個mutS所識別后，新合成鏈即被切除[9]，其中mutS是一個包含MMR蛋白hMSH2和hMSH6的異二聚體復(fù)合物。當(dāng)另一條鏈合成時，修復(fù)循環(huán)再次發(fā)生，這些無效插入切除胸腺嘧啶的過程導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和凋亡[10]。因此，敏感細(xì)胞系SHG-44加入替莫唑胺 24 h后，細(xì)胞周期阻滯在G2期，此時激活DNA修復(fù)功能，人類細(xì)胞中hMSH2和hMSH6組成的異源二聚體mutS主要識別堿基錯誤配對和單個無配對甲基環(huán)，hMSH2和hMSH3組成的異源二聚體mutS主要識別多個堿基插入或缺失產(chǎn)生的無配對堿基環(huán)[11]。mutS蛋白與錯配堿基結(jié)合，并有MutH和MutL蛋白被募集到附近形成復(fù)合物，其中MutH結(jié)合在半甲基化GATC序列上，在甲基化堿基的對側(cè)鏈切割DNA，啟動修補合成[12]。如果DNA損傷不能被修復(fù)，細(xì)胞周期檢測點就會啟動細(xì)胞周期永久停滯機制或者凋亡機制[13]。而如果MMR受損或者缺失將導(dǎo)致MMR無法識別替莫唑胺造成的G-A或者A-C錯配，在DNA損傷情況下細(xì)胞存活。這將導(dǎo)致DNA復(fù)制，并允許細(xì)胞周期繼續(xù)，由此使得細(xì)胞對替莫唑胺耐藥[14]。因此，SHG-44/TR加入替莫唑胺 24 h后，細(xì)胞周期變化較小，沒有周期阻滯現(xiàn)象。此外，耐藥細(xì)胞SHG-44/TR增殖減慢，消耗能量增加，導(dǎo)致了微環(huán)境的弱酸性。而膠質(zhì)瘤細(xì)胞微環(huán)境的酸化也是引起耐藥的一個重要原因，這些酸性物質(zhì)能被各種離子泵轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外, 使腫瘤細(xì)胞外環(huán)境呈酸性, 從而抑制了弱堿性抗腫瘤藥物替莫唑胺在腫瘤細(xì)胞中的聚集而產(chǎn)生一定的耐藥性[15]。

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Biological characteristics and resistance mechanism of temozolomide resistance cell line SHG-44/TR

DINGFengxia,ZHUZhongling,YANZhao

(TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital,Tianjin300060,China)

Abstract:Objective To investigate the biological characteristics and resistance mechanism of human glioma cell line SHG-44/TR which is resistant to temozolomide (TMZ). MethodsWe induced the human glioma SHG-44 to be resistant to TMZ by dose escalation in vitro, and then established the drug-resistant cell line SHG-44/TR. The colony formation assay and MTT colorimetric assay was used to measure the proliferation, resistance and resistance index of SHG-44/TR cells; Western blotting was used to detect the expression changes of resistance protein O6-methylguanine-DNA methyl transferase (MGMT) and human mismatch repair protein 2 (hMSH2); and flow cytometry was used to detect the SHG-44/TR cell cycle. ResultsAfter eight months, we successfully established TMZ-resistant glioma cells SHG-44/TR. Significant difference was found in the TMZ-resistance between SHG-44 and SHG-44/TR (P<0.05). SHG-44/TR had no cell cycle arrest phenomenon. The expression of MGMT protein did not change in SHG-44/TR cells as compared with that of parent cells, but the expression of hMSH2 was significantly decreased (P<0.05). ConclusionsThe hMSH2 expression of TMZ-resistant glioma cells SHG-44/TR is decreased, and the mechanism may be DNA mismatch repair missing.

Key words:temozolomide; drug-resistance mechanism; glioma; mismatch repair; O6-methylguanine-DNA methyltransferase

(收稿日期：2015-08-14)

中圖分類號：R739.41

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)05-0019-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.05.007

通信作者簡介：閻昭(1973-)，男，主任藥師，研究方向為腫瘤藥理學(xué)。參與或承擔(dān)國家 863 課題、“十二五”重大新藥創(chuàng)制重大專項子課題、“十一五”重大新藥創(chuàng)制重大專項子課題、天津市科技支撐計劃重點項目等多項課題研究。E-mail：yanzhaopaper@163.com

作者簡介：第一丁鳳霞(1990-)，女，在讀碩士，研究方向為腫瘤藥理學(xué)。E-mail：FengxDing@126.com

基金項目：“十二五”重大新藥創(chuàng)制科技重大專項課題(2013ZX09303001)；國家自然科學(xué)基金項目(81402481)；天津衛(wèi)生局科技基金項目(2014KZ085)。