周 莎，彭 樺，劉 健，胡進耀*，余凌帆，毛波勇

（1.綿陽師范學院，生命科學與技術學院，四川綿陽 621000；2.四川省林業(yè)科學研究院，四川成都 610081；3.天全縣林業(yè)局，四川天全 625500）

通過糞便確定大熊貓的性別方法研究

周 莎1，彭 樺1，劉 健1，胡進耀*1，余凌帆2，毛波勇3

（1.綿陽師范學院，生命科學與技術學院，四川綿陽 621000；2.四川省林業(yè)科學研究院，四川成都 610081；3.天全縣林業(yè)局，四川天全 625500）

本文采用SDS、核酸吸附柱提取了大熊貓糞便中的DNA，根據(jù)大熊貓性別決定因子基因序列設計引物，以非性別特異性的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因片段（BDNF）作為正對照。使用人工飼養(yǎng)的大熊貓糞便DNA進行驗證引物的有效性，結果表明該引物鑒定結果可靠。實驗表明該方法方便快捷、可靠有效。

大熊貓；DNA提??；性別鑒定

大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）是我國瀕危保護動物（陳遠飛，1986），是生物多樣性保護的旗艦物種。保護大熊貓及其棲息地是保護生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)功能完整性與穩(wěn)定性的重要保障（申國珍，2008）。通過保護大熊貓旗艦種來保護其生存的整個生態(tài)系統(tǒng)，保護該生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性，大熊貓作為保護其他珍稀物種及生物多樣性保護的旗艦種己經(jīng)成為了保護行為的一種象征。

性別鑒定是研究和保護野生大熊貓種群的一個重要課題。近年來隨著分子生物學的發(fā)展，非損傷性取樣或非損傷性基因取樣在不傷害或觸及動物的前提下收集脫落的毛發(fā)、糞便、口腔脫落細胞、陳舊皮張等作為分析樣品獲取樣品中的DNA（魏輔文等，2001；李明等，2002；張于光等，2003；劉海等，2003；史燕等，2004）。由于非損傷性取樣的廣泛性、隨機性和便利性，使其在物種鑒別、個體識別、性別鑒定、種群親緣關系鑒定、種群數(shù)量估計等方面得到了廣泛的應用（陳璐，2007）。睪丸決定基因位于Y染色體上，哺乳動物在發(fā)育期的性腺分化主要依賴于雄性特有的Y染色體（楊曉娟，1999）。隨著性別決定的分子生物學機制的深入研究，以及P C R技術的廣泛應用，近年來很多研究者應用哺乳動物Y染色體上連鎖的特定基因P C R進行擴增，鑒定動物性別，如（田新民，2008）通過Z F Y基因對奶牛的性別鑒定（龔榮慈，1997）；SR Y基因對野生狍性別鑒定（楊寶田，2005）。本研究擬通過對人工大熊貓性別的研究，探索大熊貓非損傷性性別鑒定的實驗方法。

1 材料與方法

材料：大熊貓戴麗、傲傲、怡暢、英英糞便樣本均采自都江堰大熊貓人工繁育基地、取樣方法為非損傷性取樣。方式為采集新鮮的大熊貓糞便。

基因組DNA提?。河梅印确路▽S便樣本DNA進行提取。方法提取產(chǎn)物的含量和純度在凝膠電泳儀上進行檢測。（張保衛(wèi)，2004）

PCR擴增：PCR反應體系20μl，重蒸餾水14.5 μl，10×buffer 2μl，dNTP1.5μl，

引物1 0.5μl，引物2 0.5μl，模板DNA 1μl，Taq酶0.2μl。在NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫上查找大熊貓性別決定因子SRY（Sex Determining Region Y）基因序列。NCBI基因登錄號AB292070.1，如圖3所示。根據(jù)該序列使用DNAMAN軟件設計的一對引物：

SRY F 5’-AGTTAGGCAGTGTTGTGTGACC-3’

SRY R 5’-ATAGTCTGGGTATTTCTCTCGGTC-3’

預期擴增片段600 bp左右。

為了保證結果的準確性，參考相關文獻選用大熊貓腦源性神經(jīng)因子基因BDNF作為對照基因，設計對照引物基因：

BDNF F 5’-TCGGTTGCATGAAGGC-3’

BDNF R 5’-TTGCTATCCATGGTAAGGG-3’

其擴增程序為：預變性：94℃，4min變性：95℃，45 s退火：50.4℃，45 s延伸：72℃，50 s，變性、退火、延伸共35個循環(huán)；最末一個循環(huán)緊接72℃再延伸10 min補缺口。

電泳及結果記錄：取10μLPCR擴增基因產(chǎn)物，在3%的瓊脂糖凝膠上電泳30 min，用凝膠成像儀（VilberLourmat公司）進行拍照并記錄結果?；螂娪窘Y果中，單條帶表示此個體性別為雄性，雙帶表示此個體性別為雌性。

2 結果與分析

2.1 引物SRY、BDNF擴增結果

4只人工飼養(yǎng)大熊貓的詳細資料（見表1）。

表1 人工飼養(yǎng)大熊貓糞便采集信息

2.2 不同預處理對提取DNA的影響

2.2.1 人工飼養(yǎng)大熊貓DNA提取

由圖1可知，未預處理提取的DNA效果好，條帶清晰，目標DNA質量較高，碎片少；用乙醇預處理提取的DNA碎片較多；用丙酮預處理的DNA碎片多，條帶不清晰。

根據(jù)圖1的DNA提取結果，我們得出用SDS法提取及核酸吸附柱純化回收DNA效果較好，我們決定采用之前的提取方法并用丙酮及乙醇預處理。

圖1 熊貓傲傲DNA檢測

實驗結果如圖2所示：4只大熊貓都提取出了比較清晰完整的DNA條帶，M1熊貓戴麗食物不是純竹葉，糞便中殘留了大量的水果消化殘渣，提取出的條帶有彌散現(xiàn)象，其它3個樣品條帶較好。F1DNA濃度較低，質量差，DNA破碎嚴重，雜DNA較多；F2目標DNA質量較好，有大量小段DNA；M1 DNA破碎嚴重，可能有較多雜質DNA；M2DNA質量較好。

2.3 不同退火溫度擴增的結果

對人工飼養(yǎng)4只大熊貓糞便DNA進行了PCR擴增所得到的結果，加入SRY基因引物的是實驗組，加入BDNF基因引物的是對照組。本次PCR擴增分別用大熊貓SRY基因引物及BDNF基因引物擴增對4只人工養(yǎng)殖的大熊貓DNA進行PCR擴增。

用提取質量較好的M2 DNA為模板，如上所示進行溫度梯度PCR擴增，設置了5組溫度，分別是48℃、50.4℃、51.6℃、54℃、56℃進行擴增以確定最佳的退火溫度，結果如圖3所示。SRY基因擴增最佳退火溫度在50℃左右，擴增的條帶大小為500 bp左右，BDNF基因最佳退火溫度在48℃左右。（圖3和圖4）

圖3 SRY溫度梯度PCR檢測結果

3 結論

在采集大熊貓糞便過程中，盡量選取7 d以內的表面帶有粘膜的新鮮糞便，用此糞便提取DNA效果較好。在保存樣品中不同的保存方法在劉艷華等人的論述中已有了較全面的論述（劉艷華，2006），我們參考鐘華等人使用丙酮預處理樣品（鐘華，2003）發(fā)現(xiàn)丙酮影響后續(xù)DNA的質量，參考使用乙醇預處理樣品也發(fā)現(xiàn)乙醇影響后續(xù)DNA的處理。實驗結果表明，直接采用冷藏保存處理方便，提取的DNA效果好。

圖4 BDNF溫度梯度PCR檢測結果

影響糞便D N A提取的因素除了保存方法外，動物的取食和環(huán)境的溫度也會影響。（G oossens et al，2000；Melanie et al.，2003；Lucchini et al，2002）提取DNA使用SDS和核酸純化柱方法提取，提取DNA質量好，方便快捷，便于后續(xù)的PCR實驗。由于糞便中含有DNA聚合酶抑制物、植物多糖等PCR抑制劑，傳統(tǒng)的提取純化方法不能將其去除，便會影響PCR擴增的結構，所以選擇使用乙醇提取純化糞便中的DNA，并將其用于PCR檢測。

根據(jù)NCBI上面公布的大熊貓的性別決定基因序列，采用DNAMAN軟件設計的特異性引物，擴增效果好，特異性高。對照引物采用田新民等使用的大熊貓腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因片段（BDNF）引物（田新民，2008），在50攝氏度左右擴增效果最好。

通過糞便DNA擴增鑒定的4只人工飼養(yǎng)的大熊貓的性別與實際相符，表明我們的鑒別方法方便、快捷、準確，可以對野外鑒定大熊貓性別起到重要的作用。

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A M ethod of Sex-determ ination Pandas Tests of Giant

ZHOU Sha1PENG Hua1HU Jin-yao*1YU Ling-fan2MAO Bo-yong3

（1.College of Life Science＆Biotechnology，Mianyang Normal University，Mianyang 621000，China；2.Sichuan Academy of Forestry，Chengdu 610081，3.Tian Quan Forestry Bureau in Sichuan Province，Tianquan 625500，China）

In this paper，Using SDSand nucleic acid adsorption column to extraction of the giant panda fecal DNA.According to the giant panda sex determination gene primers design factor，take BDNF as the positive control.Validation of the effectiveness of the primers for the use of fecal DNA from artificially reared giant pandas.The results showed that the resultswere reliable for the identification of the primers. Experiments show that thismethod is convenient and reliable.

Panda，DNA extraction，Determination of sex

Q958

A

1003-5508（2016）06-00-0

2016-09-07

天全縣喇叭河-紫石-二郎山大熊貓基因交流走廊帶建設項目、天全縣大熊貓棲息地修復項目調查監(jiān)測及技術培訓部分項目（項目編號：天政采招［2014］28號）；國家自然科學基金項目（31170319）。

周莎（1992-），綿陽師范學院本科生。

胡進耀，博士、教授，主要從事生態(tài)系統(tǒng)健康與安全維護研究。