徐園園，魏迎鳳，盧學(xué)超，解其華，翟林云 (南通市第三人民醫(yī)院，江蘇南通226000)

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活性維生素D3灌胃治療大鼠糖尿病腎病的效果及其作用機(jī)制

徐園園，魏迎鳳，盧學(xué)超，解其華，翟林云 (南通市第三人民醫(yī)院，江蘇南通226000)

摘要：目的觀察活性維生素D3灌胃治療大鼠糖尿病腎病的效果，并探討其機(jī)制。方法 雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組及實(shí)驗(yàn)3組各8只。模型組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組及實(shí)驗(yàn)3組采用鏈脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病腎病大鼠模型，對(duì)照組注射同體積的枸櫞酸鉀緩沖液。實(shí)驗(yàn)1、2、3組分別以0.03、0.06、0.12 μg/(kg·d)骨化三醇(活性維生素D3)灌胃，1次/d，模型組與對(duì)照組以等量花生油灌胃。各組均連續(xù)用藥8周。灌胃結(jié)束后測(cè)定24 h尿蛋白(24 h UTP)、空腹血糖(FBG)、血清尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、血鈣、血磷、25-(OH)D3及甲狀旁腺激素(PTH)。留取標(biāo)本后處死各組大鼠，取腎臟組織，HE染色，光鏡下觀察腎臟病理學(xué)改變；采用免疫組化法檢測(cè)各組大鼠腎臟組織中的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)蛋白。結(jié)果實(shí)驗(yàn)1、2、3組及模型組的FBG、24 h UTP、BUN、Scr均高于對(duì)照組(P均<0.05)；實(shí)驗(yàn)1、2、3組的24 h UTP、BUN、Scr低于模型組，其中實(shí)驗(yàn)3組24 h UTP低于實(shí)驗(yàn)1組(P均<0.05)。實(shí)驗(yàn)1、2、3組腎臟病理改變較模型組減輕，以實(shí)驗(yàn)3組最為明顯。模型組腎臟組織中TGF-β1、CTGF表達(dá)高于對(duì)照組(P均<0.05)；實(shí)驗(yàn)1、2、3組TGF-β1、CTGF表達(dá)低于模型組，其中實(shí)驗(yàn)3組TGF-β1、CTGF表達(dá)低于實(shí)驗(yàn)1組(P均<0.05)。與實(shí)驗(yàn)1組相比，實(shí)驗(yàn)3組PTH水平下降，血鈣、血磷水平升高(P均<0.05)。結(jié)論 活性維生素D3灌胃可減輕糖尿病腎病大鼠腎組織病理改變，改善腎功能，其機(jī)制可能與下調(diào)TGF-β1、CTGF表達(dá)有關(guān)；但活性維生素D3以0.12 μg/(kg·d)劑量使用將影響骨質(zhì)代謝。

關(guān)鍵詞：糖尿病并發(fā)癥；糖尿病腎病；活性維生素D3；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

糖尿病腎病是導(dǎo)致糖尿病患者終末期腎衰竭的重要原因。目前認(rèn)為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)是糖尿病患者腎小球硬化形成過(guò)程中的重要生長(zhǎng)因子[1]。近年來(lái)，活性維生素D3的腎臟保護(hù)作用備受關(guān)注。2014年8~12月，本研究觀察了活性維生素D3對(duì)大鼠糖尿病腎病的治療作用，并探討其機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑健康雄性SD大鼠40只，清潔級(jí)，體質(zhì)量(260±20)g，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。骨化三醇膠丸(活性維生素D3)購(gòu)自上海羅氏制藥有限公司；鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，用前溶解于0.1 mol/L的檸檬酸緩沖液中，pH 4.5；兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；兔抗大鼠CTGF多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；即用型SABC-POD(兔IgG)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2動(dòng)物模型制作及活性維生素D3用法大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組及實(shí)驗(yàn)3組各8只。模型組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組及實(shí)驗(yàn)3組大鼠禁食12 h后以60 mg/kg的STZ于左下腹腔一次性注射制造糖尿病腎病模型，以建模72 h后血糖濃度≥16.7 mmol/L、尿量多于原尿量150%、24 h尿蛋白排泄率>30 mg判定為造模成功。對(duì)照組注射同體積的枸櫞酸鉀緩沖液[2]。實(shí)驗(yàn)1、2、3組將骨化三醇溶于0.05 mL花生油，分別以0.03、0.06、0.12 μg/(kg·d)灌胃，模型組與對(duì)照組以等量花生油灌胃。各組均連續(xù)用藥8周。于實(shí)驗(yàn)第8周末收集大鼠尿液，采血，解剖腎臟去除包膜，留取腎臟組織。

1.3大鼠腎功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)于實(shí)驗(yàn)第8周末留取標(biāo)本后處死大鼠。處死前1 d，將大鼠放入洗凈的代謝籠內(nèi)，禁食不禁水，收集24 h尿液，用雙縮脲法測(cè)定24 h UTP。采用全自動(dòng)多功能生化分析儀進(jìn)行測(cè)定FBG、血清BUN、Scr、血鈣、血磷。采用羅氏電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清25羥維生素D3[25-(OH)D3]。采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法檢測(cè)血清PTH。

1.4大鼠腎臟組織病理觀察留取各組大鼠腎組織，置于4%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片，行HE染色，光鏡下觀察腎組織病理改變。

1.5大鼠腎臟組織中TGF-β1、CTGF檢測(cè)采用免疫組化法檢測(cè)大鼠腎臟組織中TGF-β1、CTGF。以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為TGF-β1、CTGF表達(dá)陽(yáng)性，光鏡下(400×)每張切片隨機(jī)選取10個(gè)區(qū)域，采用Mias-2000圖像分析系統(tǒng)測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞的積分光密度，以此代表TGF-β1、CTGF相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1各組大鼠腎功能相關(guān)指標(biāo)比較實(shí)驗(yàn)1、2、3組及模型組的FBG、24 h UTP、BUN、Scr均高于對(duì)照組(P均<0.05)；實(shí)驗(yàn)1、2、3組的24 h UTP、BUN、Scr低于模型組(P均<0.05)，其中實(shí)驗(yàn)3組24 h UTP低于實(shí)驗(yàn)1組(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠腎功能相關(guān)指標(biāo)比較±s)

注：與對(duì)照組相比，#P<0.05；與模型組相比，*P<0.05；與實(shí)驗(yàn)1組相比，△P<0.05。

2.2各組大鼠腎臟病理改變對(duì)照組腎小球體積正常，系膜細(xì)胞及基質(zhì)正常，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組腎小球體積增大，腎小球系膜基質(zhì)增寬，部分腎小球硬化，并有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；實(shí)驗(yàn)1、2、3組腎小球體積減小，系膜增生改善，炎癥細(xì)胞減少，以實(shí)驗(yàn)3組最為明顯。

2.3各組大鼠腎臟組織中TGF-β1、CTGF表達(dá)比較模型組腎臟組織中TGF-β1、CTGF表達(dá)高于對(duì)照組(P均<0.05)；實(shí)驗(yàn)1、2、3組的TGF-β1、CTGF表達(dá)低于模型組(P均<0.05)，其中實(shí)驗(yàn)3組TGF-β1、CTGF表達(dá)低于實(shí)驗(yàn)1組(P均<0.05)。詳見(jiàn)表2。

2.4各組大鼠骨質(zhì)代謝指標(biāo)比較與對(duì)照組比較，模型組25-(OH)D3下降、PTH升高(P均<0.05)；與模型組比較，實(shí)驗(yàn)1、2、3組25-(OH)D3升高、PTH下降，實(shí)驗(yàn)2組血磷水平升高，實(shí)驗(yàn)3組血鈣、血磷水平升高(P均<0.05)；實(shí)驗(yàn)2、3組25-(OH)D3、血磷水平高于實(shí)驗(yàn)1組(P均<0.05)；實(shí)驗(yàn)3組PTH低于實(shí)驗(yàn)1組、血鈣水平高于實(shí)驗(yàn)1組(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表2　各組大鼠腎臟組織中TGF-β1、CTGF表達(dá)比較

注：與對(duì)照組相比，#P<0.05；與模型組相比，*P<0.05；與實(shí)驗(yàn)1組相比，△P<0.05。

表3　各組大鼠25-(OH)D3、PTH、血鈣、血磷水平比較±s)

注：與對(duì)照組相比，#P<0.05；與模型組相比，*P<0.05；與實(shí)驗(yàn)1組相比，△P<0.05。

3討論

糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未闡明。糖尿病腎病的共同病理變化為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)進(jìn)行性積聚，細(xì)胞因子在此過(guò)程中起關(guān)鍵作用。在糖尿病腎病患者中，高血糖、蛋白糖基化、腎小球內(nèi)壓升高等因素均能刺激TGF-β1、CTGF等多種細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá)，引起ECM合成及降解失衡，促使ECM在腎臟過(guò)度積聚，并最終導(dǎo)致腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。

TGF-β1是目前研究最多、最重要的促纖維化因子之一，其在糖尿病腎病的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有報(bào)道，糖尿病腎病大鼠腎臟組織中TGF-β1mRNA、蛋白表達(dá)均顯著增高，且與腎臟損害的嚴(yán)重程度相關(guān)[3，4]。TGF-β1參與了腎小球硬化發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)[5~8]。TGF-β1可通過(guò)smad3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路使腎小球系膜細(xì)胞合成過(guò)多纖維連接蛋白，加重腎小球硬化[5]；TGF-β1可下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)表達(dá)，增強(qiáng)MMP特異性抑制物合成，從而促進(jìn)系膜細(xì)胞合成及ECM分泌，導(dǎo)致基底膜增厚、系膜細(xì)胞增殖，引起腎小球硬化[6，7]。CTGF在維持細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用[9]。CTGF可被TGF-β1誘導(dǎo)并激活，并可作為TGF-β1的下游介質(zhì)，與TGF-β1共同參與腎小球肥大、系膜細(xì)胞增殖、ECM積聚等過(guò)程。Yamanaka等[10]在體外實(shí)驗(yàn)中抑制人結(jié)膜成纖維細(xì)胞內(nèi)源性CTGF表達(dá)，發(fā)現(xiàn)即使在培養(yǎng)液中加入TGF-β1，Ⅰ型膠原蛋白、纖維連接蛋白等ECM成分表達(dá)也顯著減少，說(shuō)明CTGF表達(dá)受TGF-β1調(diào)節(jié)，同時(shí)也可調(diào)節(jié)TGF-β1活性。CTGF生物學(xué)效應(yīng)較為單一，阻斷CTGF表達(dá)或抑制其生物活性有望成為治療腎臟纖維化的新手段。

活性維生素D3是一種脂溶性維生素，有調(diào)節(jié)鈣磷代謝及骨質(zhì)形成的作用。近期研究[11]證實(shí)，活性維生素D3還具有抗炎、抑制腎素血管緊張素系統(tǒng)、減少尿蛋白、調(diào)節(jié)免疫等作用。糖尿病腎病患者普遍存在活性維生素D3缺乏。研究[12，13]表明，應(yīng)用活性維生素D3治療糖尿病腎病大鼠可改善腎小球?yàn)V過(guò)屏障功能，減輕炎癥反應(yīng)，減輕足細(xì)胞損傷，減少蛋白尿，并可下調(diào)TGF-β1水平，從而起到延緩腎小球硬化的作用。楊燁等[14]發(fā)現(xiàn)TGF-β1表達(dá)水平越高，糖尿病腎病大鼠腎臟病理改變?cè)絿?yán)重，且活性維生素D3可通過(guò)下調(diào)TGF-β1表達(dá)而保護(hù)腎臟。目前尚無(wú)活性維生素D3治療糖尿病腎病的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于適宜藥物劑量及該藥對(duì)骨質(zhì)代謝的影響仍未明確。

本研究制備了大鼠糖尿病腎病模型，并給予活性維生素D3干預(yù)，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)1、2、3組的24 h UTP、BUN、Scr低于模型組，其中實(shí)驗(yàn)3組24 h UTP低于實(shí)驗(yàn)1組；實(shí)驗(yàn)1、2、3組腎臟病理改變較模型組減輕，以實(shí)驗(yàn)3組最為明顯；實(shí)驗(yàn)1、2、3組的TGF-β1、CTGF表達(dá)低于模型組。上述結(jié)果再次證實(shí)TGF-β1、CTGF參與了糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展[15]，而給予活性維生素D3治療可減輕腎臟組織病理改變，改善腎功能，這些治療作用可能與下調(diào)TGF-β1、CTGF表達(dá)有關(guān)。值得注意的是，實(shí)驗(yàn)3組PTH水平下降，血鈣、血磷水平升高，提示活性維生素D3劑量過(guò)大[0.12 μg/(kg·d)]可影響骨質(zhì)代謝，故治療劑量還應(yīng)謹(jǐn)慎選擇。對(duì)于臨床如何使用活性維生素D3治療糖尿病腎病仍需大量的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Qi W, Chen X, Poronnik P, et al. Transforming growth factor-beta/connective tissue growth factor axis in the kidney[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2008,40(1):9-13.

[2] 李偉,張紅,殷松樓,等.不同劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)SD大鼠糖尿病腎病模型的研究[J].徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,26(1):52-55.

[3] Guo B, Koya D, Isono M, et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma ligands inhibit TGF-beta 1-induced fibronectin expression in glomerular mesangial cells[J]. Diabetes, 2004,53(1):200-208．

[4] Hill C, Flyvbjerg A, Gronbaek H, et al. The renal expression of transforming growth factor-beta isoforms and their receptors in acute and chronic experimental diabetes in rats[J]. Endocrinology, 2000,141(3):1196-1208．

[5] Isono M, Chen S, Hong SW, et al. Smad pathway is activated in the diabetic mouse kidney and Smad 3 mediates TGF-beta-induced fibronectin in mesangial celIs[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2002,296(5):1356-1365.

[6] McLennan SV, Fisher E, Martell SY, et al. Effects of glucose on matrix metalloproteinase and plasmin activities in mesangial cells： possible role in diabetic nephropathy[J]. Kidney Int Suppl, 2000,77:S81-87.

[7] Zhang D, Sun L, Xian W, et al. Low-dose paclitaxel ameliorates renal fibrosis in rat UUO model by inhibition of TGF-beta/Smad activity[J]. Lab Invest, 2010,90(3):436-447．

[8] Isaka Y, Fujiwara Y, Ueda N, et al. Glomerulosclerosis induced by in vivo transfection of transforming growth factor-beta or platelet-derived growth factor gene into the rat kidney[J]. J Clin Invest, 1993,92(6):2597-2601.

[9] Briqstock DR. The CCN family： a new stimulus package[J]． J Endocrinol, 2003,178(2):169-175.

[10] Yamanaka O, Saika S, Ikeda K, et al. Connective tissue growth factor modulates extracellular matrix production in human subconjunctival fibroblasts and their proliferation and migration in vitro[J]. Jpn J Ophthalmol, 2008,52(1):8-15.

[11] Williams S, Malatesta K, Keith Norris K. Vitamin D and chronic kidney disease[J]. Ethn Dis, 2009,19(4 Suppl 5)：S5-8-11．

[12] Zhang Z, Zhang Y, Ning G, et al. Combination therapy with AT1 blocker and vitamin D analog markedly ameliorates diabetic nephropathy： blockade of compensatory renin increase[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008,105(41):15896-15901．

[13] 蘭凱,羅群,周芳芳,等.帕立骨化醇對(duì)糖尿病腎病大鼠蛋白尿的影響[J].中華腎臟病雜志,2012,28(7):524-527．

[14] 楊燁,張園園,田燕燕,等.活性維生素D3對(duì)糖尿病腎病大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1及相關(guān)因子的調(diào)節(jié)作用[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志,2015,31(1):66-70.

[15] 于倩,張沫,劉德敏.TGF-β1、CTGF基因的過(guò)表達(dá)與早期糖尿病腎病關(guān)系的研究[J].天津醫(yī)藥,2012,40(3):262-265.

(收稿日期：2015-10-27)

中圖分類號(hào)：R587.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)03-0031-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.03.011

基金項(xiàng)目：南通市衛(wèi)生局青年科研基金資助項(xiàng)目(WQ2014029)。