周月宏，田堅(jiān)，沈靜雪，趙曉偉(沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院，沈陽 110024)

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SOCS2基因轉(zhuǎn)染對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞TGF-β、Ⅳ型膠原蛋白、纖維連接蛋白表達(dá)的影響

周月宏，田堅(jiān)，沈靜雪，趙曉偉(沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院，沈陽 110024)

摘要：目的觀察過表達(dá)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(SOCS2)對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞(HMCs)中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、Ⅳ型膠原蛋白(Collagen Ⅳ)、纖維連接蛋白(FN)表達(dá)的影響，并探討其可能機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)HMCs，分為A、B、C、D、E、F組，A、B組分別加入Ad-SOCS2病毒液(含SOCS2的腺病毒病毒液)、Ad-null病毒液(只含腺病毒的病毒液)，24 h后將培養(yǎng)液更換成高糖培養(yǎng)液；C組加入30 mmol/L的D-葡萄糖；D、E組分別加入Ad-SOCS2病毒液、Ad-null病毒液，24 h后將培養(yǎng)液更換成常規(guī)培養(yǎng)液；F組加入5.5 mmol/L的D-葡萄糖+24.5 mmol的D-甘露醇。Western blotting法檢測(cè)各組TGF-β、Collagen Ⅳ、FN及賈納斯激酶2(JAK2)、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、磷酸化賈納斯激酶2(p-JAK2)、磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(p-STAT3)。結(jié)果與F組比較，A、B、C組TGF-β、Collagen Ⅳ、FN、p-JAK2、p-STAT3的相對(duì)表達(dá)量升高；與C組比較，A組TGF-β、Collagen Ⅳ、FN、p-JAK2、p-STAT3的相對(duì)表達(dá)量降低；P均<0.01。結(jié)論 SOCS2通過抑制JAK/STAT信號(hào)通路來下調(diào)HMCs中TGF-β、Collagen Ⅳ、FN表達(dá)。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子；腎小球系膜細(xì)胞；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β；Ⅳ型膠原蛋白；纖維連接蛋白

糖尿病腎病(DN)是由糖尿病引起的一種危害性大的慢性并發(fā)癥，腎小球系膜細(xì)胞作為DN的主要效應(yīng)細(xì)胞，在DN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。近年來，有關(guān)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(SOCS)抑制細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究取得進(jìn)展，特別是對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路的負(fù)反饋?zhàn)饔帽蛔C實(shí)。JAK/STAT信號(hào)通路被證實(shí)與腎臟疾病的足細(xì)胞、系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞的病理改變相關(guān)[1]。研究[2,3]認(rèn)為，SOCS1、SOCS3對(duì)DN腎組織有保護(hù)作用，而SOCS2是否對(duì)其有保護(hù)作用尚不清楚。2014年3～8月，我們觀察了過表達(dá)SOCS2對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞中纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，并探討其可能機(jī)制，為DN的防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料人腎小球系膜細(xì)胞(HMCs)、SOCS2抗體，Ⅳ型膠原蛋白(Collagen Ⅳ)、賈納斯激酶2(JAK2)、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、磷酸化賈納斯激酶2(p-JAK2)、磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(p-STAT3)抗體；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)抗體；胎牛血清；纖維連接蛋白(FN)抗體；DMEM低糖培養(yǎng)基；Polybrene；SOCS2腺病毒套裝；PMSF、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、一抗二抗去除液、羊抗兔IgG-HRP、NP-40裂解液；β-actin和辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠單克隆抗體；ECL發(fā)光液。

1.2HMCs培養(yǎng)及高糖處理將HMCs接種于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至密度為90%左右，PBS清洗。棄上清，加入適當(dāng)體積的0.25%胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓后，輕輕拍打瓶壁側(cè)面，并加入常規(guī)培養(yǎng)基終止反應(yīng)。用5 mL槍頭吹打細(xì)胞瓶?jī)?nèi)各處細(xì)胞，15 mL試管收集混合液，800 r/min離心3 min。去上清，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容接種細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。HMCs的接種密度為1∶2，生長(zhǎng)2～3 d傳代。細(xì)胞培養(yǎng)至密度為70%左右，用PBS清洗2次。棄去上清，以PBS清洗1次，加入高糖培養(yǎng)基(將0.9 g葡萄糖溶解在200 mL含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，過濾后使用，濃度為30 mmol/L D-葡萄糖)。

1.3HMCs分組及處理將HMCs接種于6孔板中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，24 h后進(jìn)行感染，細(xì)胞密度一般在70%。實(shí)驗(yàn)分為6組。A、B組分別加入含有SOCS2的腺病毒病毒液、只含有腺病毒的病毒液(病毒數(shù)與細(xì)胞數(shù)比值為10∶1)，24 h后將含有腺病毒的培養(yǎng)液更換成高糖培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)24 h。C組：將0.9 g葡萄糖溶解在200 mL含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，過濾后使用，濃度即為30 mmol/L D-葡萄糖。D、E組分別加入含有SOCS2的腺病毒病毒液、只含有腺病毒的病毒液(病毒數(shù)與細(xì)胞數(shù)比值為10∶1)，24 h后將含有腺病毒的培養(yǎng)液更換成正常培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)24 h。F組：將0.9 g甘露醇溶解在200 mL含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，過濾后使用，濃度即為5.5 mmol/L D-葡萄糖+24.5 mmol D-甘露醇。

1.4HMCs中TGF-β、Collagen Ⅳ、FN、JAK、STAT、p-JAK2、p-STAT3檢測(cè)采用Western blotting法。收集細(xì)胞，用NP-40裂解液(含1%PMSF)裂解細(xì)胞，離心后取上清，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，同時(shí)加5×上樣緩沖液，煮沸變性5 min，-80 ℃保存?zhèn)溆?。本?shí)驗(yàn)的上樣體積20 μL，含40 μg蛋白。最后加入5 μL蛋白Marker電泳，半干轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，將SOCS2、TGF-β、Collagen Ⅳ、FN、JAK、STAT、p-JAK2、p-STAT3特異性抗體分別與膜4 ℃孵育過夜。再以相應(yīng)的二抗(1∶5 000)孵育2 h。免疫復(fù)合物使用ECL法檢測(cè)。使用Gel Pro Analyzer軟件分析條帶灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1各組TGF-β、Collagen Ⅳ、FN的相對(duì)表達(dá)量比較TGF-β、Collagen Ⅳ、FN的相對(duì)表達(dá)量比較見表1。

表1　各組TGF-β、Collagen Ⅳ、FN的相對(duì)表達(dá)量比較±s)

注：與F組比較，*P<0.01；與C組比較，△P<0.01。

2.2各組JAK、STAT、p-JAK2、p-STAT3的相對(duì)表達(dá)量比較JAK、STAT、p-JAK2、p-STAT3的相對(duì)表達(dá)量比較見表2。

表2　各組JAK、STAT、p-JAK2、p-STAT3的相對(duì)表達(dá)量比較±s)

注：與F組比較，*P<0.01；與C組比較，△P<0.01。

3討論

DN的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，由糖尿病引起的微血管病變而導(dǎo)致腎小球硬化是本癥的特點(diǎn)。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，DN由多種因素導(dǎo)致，包括血流動(dòng)力學(xué)、代謝、炎癥、氧化應(yīng)激、遺傳等[4,5]。

SOCS家族是一類對(duì)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起負(fù)性調(diào)控，從而抑制其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白分子。研究[6～9]證實(shí)，SOCS參與癌癥、肝纖維化、腎臟纖維化和各種炎癥反應(yīng)。SOCS主要通過JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)作用抑制相關(guān)細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而參與了多種生理與病理的發(fā)生發(fā)展過程。研究證實(shí)，JAK/STAT與多種腎臟疾病相關(guān)細(xì)胞及炎癥相關(guān)細(xì)胞有關(guān)。目前，對(duì)于SOCS家族的研究多集中于SOCS1和SOCS3[10～12]，而關(guān)于SOCS2的研究甚少。在腫瘤組織中，SOCS2能抑制JAK2的激活以及JAK2、STAT3的結(jié)合，SOCS2過表達(dá)可阻止STAT3激活及抑制c-Src蛋白所影響細(xì)胞的毒性[13]。有研究[10]表明，鏈佐脲菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟組織中SOCS2表達(dá)降低，胰島素可誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞SOCS2表達(dá)上調(diào)，且上調(diào)的SOCS2可以抑制IGF-1誘導(dǎo)的ERK1/2的激活，從而抑制Collagen Ⅳ的合成。我們的前期研究[14]已證實(shí)，在DN動(dòng)物模型中，SOCS2可抑制JAK/STAT和ERK1/2信號(hào)通路，調(diào)控下游基因的表達(dá)，從而抑制腎臟組織的纖維化反應(yīng)。

TGF-β是高血糖及一些導(dǎo)致腎臟損傷的生化因素的重要介質(zhì)，與DN腎臟細(xì)胞的增殖、腎小球肥大等密切相關(guān)，同時(shí)也與腎間質(zhì)的纖維化有關(guān)[15]。腎小球基底膜的膠原成分中最重要的是Collagen Ⅳ，它是典型的基質(zhì)膠原，可由活化的腎小球系膜、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等合成和分泌。所以，Collagen Ⅳ合成和降解平衡的失調(diào)是導(dǎo)致DN腎小球病理改變的主要因素之一[16]。FN是重要的細(xì)胞外基質(zhì)組成成分，正常情況下其由系膜細(xì)胞產(chǎn)生，病理狀態(tài)下系膜細(xì)胞大量表達(dá)FN等細(xì)胞外基質(zhì)成分。

本研究顯示，與F組比較，A、B、C組TGF-β、Collagen Ⅳ、FN、p-JAK2、p-STAT3的相對(duì)表達(dá)量升高；與C組比較，A組TGF-β、Collagen Ⅳ、FN、p-JAK2、p-STAT3的相對(duì)表達(dá)量降低。這說明SOCS2能通過抑制JAK/STAT信號(hào)通路及其調(diào)控的纖維化相關(guān)因子的活化與表達(dá)，從而減少纖維化，對(duì)DN的進(jìn)展起到延緩作用，為DN藥物的治療找到了新的靶點(diǎn)，同時(shí)也為該病的防控提供理論依據(jù)。

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Effect of SOCS2 gene transfection on expression of TGF-β, Collagen Ⅳ and FN in human glomerular mesangial cells

ZHOUYuehong,TIANJian,SHENJingxue,ZHAOXiaowei

(TheCenterHospitalAffiliatedtoShenyangMedicalCollege,Shenyang110024,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of overexpressing suppressor of cytokine signaling 2 (SOCS2) on the expression of transforming growth factor β (TGF-β), Collagen Ⅳ and fibronectin (FN) in human glomerular mesangial cells (HMCs) and to investigate its possible mechanisms.MethodsHMCs cultured in vitro were divided into groups A, B, C, D, E and F. Groups A and B were respectively added with Ad-SOCS2 venom (containing SOCS2 adenovirus) and Ad-null venom (containing adenovirus), after 24 h, we changed the nutrient solution into high glucose solution; group C was added with 30 mmol/L D-glucose; groups D and E were respectively added with Ad-SOCS2 venom and Ad-null venom, after 24 h, we changed the venom into conventional solution; group F was added with 5.5 mmol/L D-glucose + 24.5 mmol D-mannitol.Western blotting was used to detect the TGF-β, Collagen Ⅳ, FN and Janus kinase 2 (JAK2), signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), phosphorylated Janus kinase 2 (p-JAK2) and phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3 (p-STAT3).ResultsCompared with group F, the expression of TGF-β, Collagen Ⅳ, FN, p-JAK2, and p-STAT3 was significantly increased in the groups A, B and C; compared with group C, the expression of TGF-β, Collagen Ⅳ, FN, p-JAK2 and p-STAT3 in the group A was significantly decreased (all P<0.01). ConclusionSOCS2 can down-regulate the expression of TGF-β, Collagen Ⅳ and FN in HMCs by inhibiting JAK/STAT signaling pathway.

Key words:suppressor of cytokine signaling; mesangial cells; transforming growth factor β; Collagen IV; fibronectin

(收稿日期:2015-09-25)

中圖分類號(hào)：R587.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)03-0017-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.03.006

作者簡(jiǎn)介：第一周月宏(1978-)，女，博士，副主任醫(yī)師，副教授，主要研究方向?yàn)樘悄虿〔l(fā)癥。E-mail: zyhwylwys@163.com

基金項(xiàng)目：沈陽市科技計(jì)劃項(xiàng)目(F13-220-9-10)。