袁浩,周毅峰,尹軍,謝良伊

(1湖南省人民醫(yī)院,長(zhǎng)沙410005;2湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

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支原體肺炎患兒外周血IL-35水平變化及其與NK細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞功能的相關(guān)分析

袁浩1,周毅峰1,尹軍2,謝良伊1

(1湖南省人民醫(yī)院,長(zhǎng)沙410005;2湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

摘要：目的觀(guān)察支原體肺炎(MPP)患兒血清IL-35水平變化，并探討其與自然殺傷(NK)細(xì)胞數(shù)和中性粒細(xì)胞功能的相關(guān)性。 方法 選擇MPP患兒64例(觀(guān)察組),健康體檢兒童16例(對(duì)照組)。分別采用ELISA法檢測(cè)血清IL-35；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞所占百分比；金黃色葡萄球菌吞噬試驗(yàn)檢測(cè)中性粒細(xì)胞的吞噬功能，IL-35與NK細(xì)胞所占百分比和中性粒細(xì)胞功能之間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。 結(jié)果與對(duì)照組比較，觀(guān)察組血清IL-35水平升高(P<0.05)，NK細(xì)胞所占百分比與中性粒細(xì)胞吞噬率降低(P均<0.05)；MPP患兒外周血中IL-35水平與NK細(xì)胞數(shù)所占百分比呈負(fù)相關(guān)(r=-0.401，P﹤0.05)，IL-35水平與中性粒細(xì)胞吞噬率、吞噬指數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.373、-0.388，P均﹤0.05)。結(jié)論 MPP患兒血清IL-35水平升高，其與NK細(xì)胞數(shù)和中性粒細(xì)胞功能均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：支原體肺炎；IL-35；自然殺傷細(xì)胞；中性粒細(xì)胞

目前支原體肺炎(MPP)發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，但是大量研究認(rèn)為，其與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。白細(xì)胞介素35(IL-35)是至今發(fā)現(xiàn)的唯一一種由調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞產(chǎn)生，抑制效應(yīng)性T細(xì)胞活性的細(xì)胞因子，它的發(fā)現(xiàn)對(duì)于炎癥反應(yīng)、自身免疫病、Ⅰ型糖尿病等的免疫治療有重要意義[1,2]。研究證實(shí)，IL-35主要是由Treg細(xì)胞分泌，是Treg細(xì)胞發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)控的主要細(xì)胞因子[3，4]。國(guó)內(nèi)外最新研究顯示，IL-35 能抑制效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞、Th17 和CD8+T細(xì)胞的增殖，但與其他非T 細(xì)胞(NK 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、Mφ等)的關(guān)系仍然未知。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究證實(shí)，非T細(xì)胞在MPP患兒疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了與T細(xì)胞同樣重要的作用。本研究觀(guān)察了小兒MPP患者外周血IL-35的水平變化，并探討了其與NK 細(xì)胞及中性粒細(xì)胞功能的相關(guān)性。現(xiàn)報(bào)告如下。

1.1臨床資料選擇2015年1～5月本院收治MPP患兒64例(觀(guān)察組)，均符合MPP診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。男36例、女28例，年齡6個(gè)月～7歲，按MP-IgM抗體滴度分為1∶80、1∶160、1∶320、1∶640四個(gè)亞組。臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽等癥狀，肺部有中小濕啰音，胸片可見(jiàn)一側(cè)肺中或下野斑片狀模糊影，MP-IgM抗體陽(yáng)性。選擇16例本院健康體檢兒童為對(duì)照組，其中男8例、女8例，年齡1～6歲。兩組性別及年齡具有可比性。

1.2標(biāo)本的采集與處理于清晨空腹抽靜脈血6 mL。其中2 mL促凝血3 500 r/min離心10 min后分離出血清，置于-70 ℃保存待檢用于IL-35檢測(cè)；2 mL EDTA-K抗凝血用于NK細(xì)胞檢測(cè)；2 mL肝素抗凝血用于中性粒細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)試驗(yàn)?？鼓诋?dāng)天采集后立即檢測(cè)。

1.3血清IL-35檢測(cè)采用ELISA法。每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100 μL，將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃ 40 min。用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4~6次，在濾紙上印干。每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50 μL(空白除外)。將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃反應(yīng)20 min。再次洗板，每孔加酶標(biāo)抗體工作液100 μL，將反應(yīng)板置37 ℃ 10 min。第3次洗板，每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗處反應(yīng)15 min。每孔加入100 μL終止液混勻，30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)吸光值。所有A值減除空白值后再行計(jì)算，以標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，作圖，畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)樣品A值計(jì)算出相應(yīng)IL-35水平。

1.4外周血中性粒細(xì)胞吞噬功能測(cè)定將金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923置水浴中加熱100 ℃ 10 min殺死細(xì)菌，用無(wú)菌生理鹽水稀釋成6×108/mL備用；吸取60 μL肝素鈉抗凝血置于潔凈凹玻片的凹孔內(nèi)，加上述葡萄球菌菌液20 μL，充分混勻。然后置入鋪有濕紗布的有蓋容器內(nèi)(此容器先放37 ℃溫箱中預(yù)溫)，在37 ℃溫箱中作用30 min，其間每隔10分鐘搖勻一次；作用完畢，取1小滴混合液置于潔凈無(wú)油污的載玻片一端，推成薄片。待干后，滴加瑞氏A染液作用1~2 min，再滴加瑞氏B染液(洗耳球吹勻)作用2~3 min，水洗印干，置油鏡下觀(guān)察。隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)中性粒細(xì)胞，分別記錄發(fā)生吞噬和未吞噬的白細(xì)胞數(shù)，對(duì)有吞噬作用的白細(xì)胞，同時(shí)記錄所吞噬的細(xì)菌數(shù)。結(jié)果分析：吞噬率即100個(gè)中性粒細(xì)胞中吞噬有細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)；吞噬指數(shù)為將100個(gè)中性粒細(xì)胞所吞噬的細(xì)菌總數(shù)除以100，得到每個(gè)白細(xì)胞吞噬細(xì)菌的平均數(shù)，即為吞噬指數(shù)。

1.5外周血NK細(xì)胞所占百分比測(cè)算采用流式細(xì)胞術(shù)。選用以下組合抗體，CD3-FITC/ CD( 16+56)-PE同時(shí)染色，圈定CD3-CD16+CD56+細(xì)胞即NK 細(xì)胞；流式管中加入50 μL MPP患兒EDTA抗凝血和CD3、CD16、CD56抗體各2 μL，混勻，室溫避光孵育20 min，然后加入1 mL溶血素反應(yīng)10 min，3 000 r/min離心10 min，去上清，加PBS溶液300 μL，用流式細(xì)胞儀測(cè)定。

2結(jié)果

2.1各組外周血IL-35水平、NK細(xì)胞所占百分比、中性粒細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)比較見(jiàn)表1。

表1　各組外周血IL-35水平、NK細(xì)胞所占百分比、中性粒細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)比較±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05;與1:160組比較，#P<0.05。2.2相關(guān)性分析MPP患兒中血清IL-35水平與外周血NK細(xì)胞所占百分比呈負(fù)相關(guān)(r=-0.401，P﹤0.05)，與中性粒細(xì)胞吞噬率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.373，P﹤0.05)，與中性粒細(xì)胞吞噬指數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.388，P﹤0.05)。

3討論

近年MPP發(fā)病年齡提前，發(fā)病率在嬰幼兒中有逐年升高趨勢(shì)，病情嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[6~7]。目前MPP發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，但是其發(fā)病機(jī)制與免疫功能相關(guān)已得到廣泛認(rèn)同，并且認(rèn)為免疫反應(yīng)是MPP致病的重要因素[8]。所以，MPP患兒的免疫功能狀況及控制其發(fā)生發(fā)展過(guò)程成為研究熱點(diǎn)。

IL-35屬于IL-12家族，2007年被證實(shí)在免疫、炎癥性疾病病情調(diào)控中扮演重要角色。新近研究顯示，IL-35可能與呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病及進(jìn)展有關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示，MPP患兒各組中血清IL-35水平均較對(duì)照組明顯升高。說(shuō)明在健康兒童機(jī)體內(nèi)IL-35表達(dá)處于正常水平，而當(dāng)MP侵入患兒機(jī)體時(shí)，引起免疫系統(tǒng)紊亂，出現(xiàn)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，此時(shí)IL-35出現(xiàn)高表達(dá)，以防止損傷程度加重。

中性粒細(xì)胞是機(jī)體最重要的炎癥細(xì)胞，是防御外來(lái)病原體的第一道防線(xiàn)。當(dāng)外來(lái)病原菌進(jìn)入機(jī)體時(shí)，炎癥因子誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞趨化和局部浸潤(rùn)，通過(guò)吞噬、呼吸爆發(fā)和脫顆粒殺滅病原體，從而發(fā)揮天然免疫清除病原體的效應(yīng)。中性粒細(xì)胞表面表達(dá)IgG Fc受體和補(bǔ)體C3b受體，也可通過(guò)調(diào)理作用促進(jìn)和增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的吞噬、殺菌作用。本研究結(jié)果顯示，MPP患兒中性粒細(xì)胞吞噬率較對(duì)照組下降，說(shuō)明MP感染機(jī)體后，機(jī)體出現(xiàn)免疫功能紊亂，表現(xiàn)為患兒免疫功能低下，易于細(xì)菌感染。其機(jī)制可能與以下原因有關(guān)：①M(fèi)P感染減少中性粒細(xì)胞表面FcrRI的表達(dá)，改變了中性粒細(xì)胞對(duì)胞外病原體的吞噬調(diào)理作用[10]，降低其吞噬功能；②MPP患兒細(xì)胞免疫功能紊亂，IgA水平升高[11]和C3水平降低[12]，IgA水平升高抑制了中性粒細(xì)胞吞噬作用或與抗原形成抗原抗體復(fù)合物，而后者封閉了中性粒細(xì)胞Fc和C3受體，致使被調(diào)理的微生物不易被中性粒細(xì)胞吞噬。C3b由C3裂解而來(lái)，C3降低必然導(dǎo)致C3b減少，使得金黃色葡萄球菌得不到調(diào)理，就不易被中性粒細(xì)胞吞噬[13]。

NK細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，某些情況下參與超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生。由于NK細(xì)胞的殺傷活性無(wú)MHC限制，不依賴(lài)抗體，因此稱(chēng)為自然殺傷活性。NK細(xì)胞通過(guò)自然殺傷和 抗體依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)功能，對(duì)獲得性免疫的啟動(dòng)至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示觀(guān)察組NK細(xì)胞所占百分比明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明MP感染患兒后，機(jī)體的非特異性免疫受到嚴(yán)重抑制，其可能機(jī)制為MP感染后抑制了NK細(xì)胞表面的受體,阻斷了介導(dǎo)信號(hào)的傳導(dǎo),使NK細(xì)胞活性被抑制[14]。

本研究還顯示， MPP患兒血清IL-35水平與 NK細(xì)胞數(shù)和中性粒細(xì)胞功能均呈負(fù)相關(guān)性。提示IL-35可能通過(guò)抑制NK細(xì)胞增殖和中性粒細(xì)胞功能而抑制過(guò)強(qiáng)的免疫反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體免受過(guò)度免疫反應(yīng)傷害。

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(收稿日期：2015-10-08)

中圖分類(lèi)號(hào)：R563.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1002-266X(2016)01-0057-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.021

基金項(xiàng)目：湖南省教育廳科研項(xiàng)目(14C0701)；長(zhǎng)沙市科技局科研項(xiàng)目(K1403060-31)；湖南省人民醫(yī)院仁術(shù)重點(diǎn)課題(2013)。