邵宏超,葛嫣然,劉巖,蘇杰,田華

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北唐山063000)

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rh-bFGF對(duì)兔視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

邵宏超,葛嫣然,劉巖,蘇杰,田華

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北唐山063000)

摘要：目的研究重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(rh-bFGF)對(duì)兔視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷(RIRI)的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。方法 66只雄性體健大耳白兔隨機(jī)分為3組：A組為RIRI組(30只)、B組為RIRI+rh-bFGF組(30只)、C組為正常假手術(shù)組(6只)，A、B組按6、12、24、48、72 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)又隨機(jī)分為5組，每組6只。造模初期，分別往A、B組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物玻璃體腔內(nèi)注入相同劑量的生理鹽水和rh-bFGF溶液，并分別于制模后5個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物摘取眼球,制作視網(wǎng)膜標(biāo)本。C組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予前房穿刺，處死并摘除眼球。組織標(biāo)本常規(guī)HE染色后觀察各組兔視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化，免疫組化法檢測(cè)c-Fos、c-Jun陽性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果C組兔視網(wǎng)膜各層次清晰、細(xì)胞平行排列且形態(tài)規(guī)則，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞呈單層排列、規(guī)則，無空泡變性。A組兔視網(wǎng)膜出現(xiàn)高度水腫，層次紊亂、細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變性，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少。B組兔視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次和細(xì)胞組織變化與A組變化大致相同，但其損害程度較A組明顯減輕。C組兔視網(wǎng)膜中未發(fā)現(xiàn)c-Fos、c-Jun表達(dá)；與A組比較，B組RIRI后5個(gè)時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜組織中 c-Fos、c-Jun陽性細(xì)胞數(shù)減少(P均<0.05)。結(jié)論 rh-bFGF對(duì)兔視網(wǎng)膜RIRI有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制c-Fos、c-Jun的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：缺血再灌注損傷；重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子；視網(wǎng)膜；c-Fos；c-Jun；兔

以視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷(RIRI)為病理生理過程的一類疾病是臨床診療過程中常見的視功能損傷性疾病，嚴(yán)重者可導(dǎo)致視功能不可逆性損傷[1]。目前研究認(rèn)為其損害機(jī)制是多方面的[2]，作為重要的早期應(yīng)答基因，c-Fos、c-Jun被認(rèn)為與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[3]。rh-bFGF是一種具有多種生物活性的神經(jīng)營養(yǎng)因子。最新研究表明，其能有效減少缺血再灌注后受損神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，但機(jī)制欠清楚[4、5]。本實(shí)驗(yàn)通過建造兔RIRI模型，并于玻璃體腔內(nèi)注射rh-bFGF后，觀察rh-bFGF對(duì)c-Fos、c-Jun表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討rh-bFGF對(duì)RIRI保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：66只雄性體健大耳白兔，購自本院動(dòng)物中心，外眼及眼底正常者納入試驗(yàn)，體質(zhì)量(2.5±0.2)kg。動(dòng)物飼養(yǎng)于相同生長環(huán)境。66只大耳白兔被隨機(jī)分為3組：A組為RIRI組(30只)、B組為RIRI+rh-bFGF組(30只)、C組為正常假手術(shù)組(6只)。A、B組按6、12、24、48、72 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)又隨機(jī)分為5組，每組6只。主要試劑：rh-bFGF由上海西塘生物科技有限公司提供，c-Fos單克隆抗體、c-Jun單克隆抗體均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2兔RIRI模型制備及rh-bFGF干預(yù)A、B組均制備RIRI模型。建立RIRI模型前，A組和B組分別往兔玻璃體內(nèi)注射相同劑量生理鹽水和rh-bFGF溶液。RIRI模型的建立采取前房加壓灌注法：以1 g/L的烏拉坦5 mg/kg注射兔耳緣靜脈，麻醉成功后固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，均選取左眼造模，A、B組給予散瞳藥散開瞳孔，準(zhǔn)備一端連有5號(hào)頭皮針、另一端連接生理鹽水輸液瓶，將頭皮針沿角鞏膜緣處穿刺入前房，將輸液瓶高度緩慢升高使其產(chǎn)生16.7 kPa壓力[5]。觀察可見：球結(jié)膜、虹膜顏色變蒼白，視網(wǎng)膜明顯水腫且蒼白。60 min后緩慢降低輸液瓶高度至動(dòng)物眼水平，此時(shí)球結(jié)膜、虹膜顏色恢復(fù)正常，視網(wǎng)膜血供恢復(fù)橘紅色，提示RIRI造模成功[6]。C組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予前房穿刺，無其他操作。

1.3視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化的觀察及c-Fos、c-Jun表達(dá)的檢測(cè) C組動(dòng)物處死并摘除眼球。A、B組于制模后5個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死并摘除眼球，組織標(biāo)本給予行HE染色和免疫組化染色。HE染色：烘干切片，脫蠟，乙醇復(fù)水，每個(gè)濃度2 min。蘇木素染色，0.5%鹽酸乙醇分化，1%氨水泛藍(lán)，1%伊紅染色，之后乙醇脫水，各濃度2 min。二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察兔視網(wǎng)膜各層組織結(jié)構(gòu)變化。c-Fos、c-Jun的檢測(cè)采用SABC免疫組織化學(xué)法。切片常規(guī)脫蠟至水，然后加入H2O2滅活內(nèi)源性酶，再加入山羊血清封閉液。之后順次加入一抗、二抗，SABC、DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察c-Fos、c-Jun表達(dá)。每只眼球隨機(jī)選取4張不同的切片，每張切片隨機(jī)取4個(gè)不同的視野，由各視野的陽性細(xì)胞數(shù)算出平均值。

2結(jié)果

2.1兔RIRI后視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化顯微鏡下C組兔視網(wǎng)膜各層次清晰、細(xì)胞結(jié)構(gòu)規(guī)整，呈平行排列，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)呈單層排列、規(guī)則，無空泡變性。A組兔視網(wǎng)膜出現(xiàn)高度水腫，層次紊亂、細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松， RGC出現(xiàn)空泡樣變性，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少。B組兔視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次和細(xì)胞組織變化與A組變化大致相同，但其損害程度較A組明顯減輕。

2.2兔視網(wǎng)膜組織中c-Fos、c-Jun蛋白的表達(dá)詳見表1。

表1　各組兔視網(wǎng)膜組織中c-Fos、c-Jun陽性

注：與B組同時(shí)間比較，*P<0.05；與A、B組同時(shí)間比較，**P<0.01；與同組6 h比較，△P<0.05；與同組12 h比較，▲P<0.05；與同組24 h比較，☆P<0.05；與同組48 h比較，★P<0.05。

3討論

研究發(fā)現(xiàn)，RIRI可通過誘導(dǎo)RGC發(fā)生凋亡，繼而導(dǎo)致視網(wǎng)膜不可逆性傷害。臨床上視網(wǎng)膜急性缺血性疾病經(jīng)過治療后，視網(wǎng)膜細(xì)胞在缺血損傷后再次進(jìn)行再灌注，視功能未得到提高反而會(huì)進(jìn)一步損害[7]。本研究結(jié)果顯示，C組兔視網(wǎng)膜各層次清晰、細(xì)胞結(jié)構(gòu)規(guī)整、RGC呈單層排列、無空泡變性。A組視網(wǎng)膜出現(xiàn)了損傷改變，B組輕于A組。提示rh-bFGF對(duì)RIRI有保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡是個(gè)復(fù)雜的過程，同時(shí)受許多凋亡基因及抗凋亡基因調(diào)控[8]，其中c-Fos、c-Jun被認(rèn)為是兩個(gè)重要的凋亡調(diào)控基因[9]。Otori等[10]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變性和RIRI組織中存在c-Fos、c-Jun的陽性表達(dá)。在哺乳動(dòng)物中，F(xiàn)OS 家族(c-Fos、FosB、Fra-1、Fra-2)和JUN 家族(c-Jun、JunB、JunD) 共同組成激活蛋白1(AP-1) ，AP-1 以同源或異源二聚體的形式發(fā)揮作用[11]。生理?xiàng)l件下，細(xì)胞中AP-1 以同源二聚體為主發(fā)揮作用，活性表達(dá)很低；當(dāng)細(xì)胞受到生理和病理因素刺激時(shí)，AP-1會(huì)以異源二聚體為主要形式發(fā)揮作用，與基因中的AP-1調(diào)節(jié)位點(diǎn)緊密結(jié)合并激活靶基因，參與細(xì)胞凋亡以及對(duì)細(xì)胞損傷的反應(yīng)，其表達(dá)水平及活性明顯增加[12]。RIRI可激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)c-Jun、c-Fos基因的表達(dá)，并進(jìn)一步激活A(yù)P-1，誘導(dǎo)執(zhí)行凋亡相關(guān)酶類與蛋白的表達(dá)，最后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、解體、死亡。

rh-bFGF是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子[13]。它與相應(yīng)受體結(jié)合后，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、促進(jìn)毛細(xì)血管增生，形成膠原纖維；可使血管細(xì)胞快速分裂增殖，進(jìn)而改善組織局部的微循環(huán)和組織的營養(yǎng)代謝狀況[14]。本實(shí)驗(yàn)中視網(wǎng)膜RIRI后給予玻璃體腔內(nèi)注入rh-bFGF，可使凋亡基因c-Fos、c-Jun蛋白的陽性表達(dá)下降，從而減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量,這可能是rh-bFGF治療RIRI的作用機(jī)制之一，為rh-bFGF能進(jìn)一步應(yīng)用于臨床治療視網(wǎng)膜缺血再灌注疾病提供了依據(jù)。

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中圖分類號(hào)：R774

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)01-0038-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.013

基金項(xiàng)目：唐山市科技計(jì)劃項(xiàng)目(12140209A-45)。