王娓娓，鮑天昊,2，張紅苗，王淑芬，肖志成， 韓劍虹

(1昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院,昆明650101；2昆明醫(yī)科大學附屬精神衛(wèi)生中心；3昆明醫(yī)科大學)

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非必需氨基酸和β-巰基乙醇對神經干細胞增殖的影響

王娓娓1，鮑天昊1,2，張紅苗1，王淑芬3，肖志成3， 韓劍虹1

(1昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院,昆明650101；2昆明醫(yī)科大學附屬精神衛(wèi)生中心；3昆明醫(yī)科大學)

摘要：目的觀察非必需氨基酸(NEAA)和β-巰基乙醇對神經干細胞(NSCs)增殖的影響。方法 取孕齡為14.5 d的雌鼠，處死后提取NSCs并培養(yǎng)，取5～7代的NSCs用于實驗，將NSCs細胞使用傳代培養(yǎng)基培養(yǎng)，并分為四組，對照組:加入磷酸鹽緩沖液(PBS) 12 μL；NEAA組:加入NEAA 10 μL，PBS 2 μL；β-巰基乙醇組:加入β-巰基乙醇2 μL, PBS 10 μL；NEAA+β-巰基乙醇組:加入NEAA 10 μL,β-巰基乙醇2 μL。通過細胞計數(shù)法計算NSCs的增殖速度，噻唑藍(MTT)法測定NSCs增殖率，RT-PCR法測定NSCs中凋亡相關基因含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)的表達，免疫組化法對NSCs進行鑒定并測定NSCs向神經元和星形膠質細胞的分化潛能。結果與對照組比較，NEAA組NSCs增殖速度、增殖率升高，Caspase-3 mRNA降低(P<0.05或<0.01)；β-巰基乙醇組及NEAA+β-巰基乙醇組NSCs增殖速度、增殖率升高，Caspase-3 mRNA、TUJ-1陽性細胞百分比、GFAP陽性細胞百分比降低，Nestin升高(P<0.05或< 0.01)。與NEAA組比較，NEAA+β-巰基乙醇組各項指標差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或<0.01)；與β-巰基乙醇組比較，NEAA+β-巰基乙醇組NSCs增殖速度、增殖率升高，Caspase-3 mRNA降低(P<0.05或<0.01)。結論 NEAA和β-巰基乙醇均能促進NSCs增殖，聯(lián)合使用起協(xié)同作用。

關鍵詞：神經干細胞；非必需氨基酸；β-巰基乙醇；增殖；分化

神經干細胞(NSCs)廣泛存在于胚胎和成年哺乳動物中樞神經系統(tǒng),是一類具有分裂潛能和自我更新能力的前體細胞，它可以通過對稱分裂和不對稱分裂方式進行自我更新并產生神經組織的各類細胞，包括神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞等[1]。NSCs的發(fā)現(xiàn)為神經系統(tǒng)變性、損傷性疾病的修復、治療開辟了新途徑。已有研究表明，非必需氨基酸(NEAA)和β-巰基乙醇能夠促進小鼠胚胎干細胞向NSCs轉化[2]，但目前尚無NEAA和β-巰基乙醇對孕14.5 d來源胎鼠的NSCs作用的相關報道。本文進行了相關探討。

1 材料與方法

1.1材料實驗動物：孕14.5 d雌鼠購于昆明醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號: SCXY(滇)-2014004。試劑：達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基- F12營養(yǎng)混合物 (DMEM-F12)培養(yǎng)基，神經基礎培養(yǎng)基(Neuronal Base)，NEAA，β-巰基乙醇，青/鏈霉素(P/S)，谷氨酸混合物,0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)，胎牛血清(FBS)，牛血清蛋白(BSA)均購自Gibco 公司。B27，噻唑藍(MTT)購自Sigma公司。表皮細胞生長因子(EGF)，堿性纖維生長因子(bFGF)，巢蛋白(Nestin),神經元Ⅲ類β微管蛋白(TUJ-1)，膠質纖維酸性蛋白(GFAP)購自Millipore公司。PCR逆轉錄試劑盒購自寶生物工程有限公司，其他RT-PCR試劑購自ABI公司。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)基因引物由Invitrogen公司合成。GAPDH:F:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′;R:5′-TTGGCTCCACCCTTCAAGTG-3′。Caspase-3:F:5′-ACCGATGTCGATGCAGCTAA-3′;R:5′-GGTGCGGTAGAGTAAGCATA-3′。

1.2培養(yǎng)基的配制NSCs原代培養(yǎng)基：向DMEM/F12培養(yǎng)基內加入2 mmol/L Gluta MAX, 2 mmol/L P/S, 4 mmol/L B27, 20 ng/mL EGF和20 ng/mL bFGF。NSCs傳代培養(yǎng)不含P/S，其余與原代培養(yǎng)基相同。NSCs貼壁培養(yǎng)基：向DMEM/F12 培養(yǎng)基內加入 50% Neuronal Base、 1% BSA、2 mmol/L Gluta MAX、4 mmol/L B27、20 ng/mL EGF和 20 ng/mL bFGF。NSCs分化培養(yǎng)基：向DMEM/F12 培養(yǎng)基內加入 50% Neuronal Base、0.5 % FBS、2 mmol/L Gluta MAX、 4 mmol/L B27。

1.3小鼠NSCs的分離和培養(yǎng)取孕齡為14.5 d的雌鼠，三溴乙醇安樂死后無菌操作取出胎鼠前腦的側腦室顆粒下層(SVZ)，剪碎，使用400 μL的0.05% Trypsin-EDTA于37 ℃消化10 min，每5分鐘吹打1次，使用DMEM-F12培養(yǎng)基終止消化。將細胞懸液在12 000 g、4 ℃離心10 min，棄上清，使用1 mL NSCs原代培養(yǎng)基重懸細胞后將NSCs種于12孔板。體外培養(yǎng)7 d，NSCs會形成生長成熟的神經球，將生長成熟的神經球進行傳代。具體操作:將神經球吸入到1.5 mL離心管，800 g、4 ℃離心5 min，棄上清，使用400 μL胰酶消化3 min，使用DMEM-F12培養(yǎng)基終止消化。將細胞懸液在800 g、4 ℃離心5 min，棄上清，使用NSCs傳代培養(yǎng)基重懸細胞, 細胞計數(shù),以2×105/孔將NSCs種于12孔板，每孔含傳代培養(yǎng)基1 mL。傳代的NSCs在體外培養(yǎng)3 d會形成成熟的神經球，繼續(xù)將神經球傳代。5～7代NSCs用于本實驗。

1.4分組及NSCs的處理NSCs傳代后以2×105/孔種于12孔板，分為四組，對照組:加入磷酸鹽緩沖液(PBS) 12 μL；NEAA組:加入NEAA 10 μL，PBS 2 μL；β-巰基乙醇組:加入β-巰基乙醇2 μL, PBS 10 μL；NEAA+β-巰基乙醇組:加入NEAA 10 μL,β-巰基乙醇2 μL。NEAA濃度為1%，β-巰基乙醇濃度為0.1 mmol/L。NSCs以1.0×105/孔種于多聚鳥氨酸(0.01%)包被過的24孔板，每孔加入0.5 mL NSCs貼壁培養(yǎng)基，體外培養(yǎng)48 h，進行免疫組化染色，對NSCs鑒定。本試驗所用細胞為傳代5～7代的NSCs，所有細胞能染色Nestin,提示我們所用細胞為NSCs。

1.5 NSCs增殖速度的測算用于實驗的NSCs使用傳代培養(yǎng)基以2×105/孔種于12孔板,按分組給予處理(同1.4)，并懸浮培養(yǎng)。48 h后收集神經球，吹散，消化后使用血細胞計數(shù)器進行活細胞計數(shù)。增殖速度=48 h后收集的活細胞數(shù)/2×105。

1.6NSCs增殖率的測算采用MTT法。NSCs以0.1×105/孔種于多聚鳥氨酸(0.01%)包被過的96孔板，每孔加入0.2 mL NSCs貼壁培養(yǎng)基并按分組給予處理(同1.4)，體外培養(yǎng)48 h，加入5 mg/mL的MTT在37 ℃作用4 h，去除培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜150 μL/孔，室溫下?lián)u床上孵育15 min，使用酶標儀(Turner BioSystems公司)450 nm測定吸光度(A值)。

1.7NSCs中Caspase-3 mRNA的檢測采用RT-PCR法。用于實驗的NSCs使用傳代培養(yǎng)基培養(yǎng)，并進行分組及處理(同1.4)。48 h后收集神經球，加入總RNA抽提試劑，提取總RNA。其余步驟按試劑盒說明書進行。

1.8GFAP、Nestin陽性細胞數(shù)的測算采用免疫組化染色法。NSCs以0.5×105/孔種于多聚鳥氨酸(0.01%)包被過的24孔板，每孔加入0.5 mL NSCs分化培養(yǎng)基，體外培養(yǎng)7 d，進行免疫組化染色(TUJ-1、Nestin、GFAP)，對NSCs向神經元和星形膠質細胞分化比例進行測定。具體步驟按試劑盒說明操作,鏡下觀察，拍片。Image J軟件計算陽性細胞所占百分比。

2結果

各組NSCs增殖速度、細胞增殖率、Caspase-3 mRNA、TUJ-1陽性細胞、GFAP陽性細胞、Nestin陽性細胞比較見表1。

表1　各組NSCs增殖速度、增殖率、Caspase-3 mRNA、TUJ-1陽性細胞、GFAP陽性細胞、Nestin陽性細胞比較

注：與對照組比較，*P< 0.05,**P< 0.01;與NEAA組比較，#P<0.05,##P<0.01；與β-巰基乙醇組比較，@P<0.05，@@P< 0.01。 3 討論

近年隨著我國人口的迅速老齡化，中樞神經系統(tǒng)退行性疾病日益增多。雖然目前已有研究報道利用NSCs移植治療阿爾茨海默病、亨廷頓病、多發(fā)性硬化、中風、脊髓損傷等神經退行性疾病[3, 4]，但是NSCs移植治療始終存在免疫排斥[5]和倫理學的挑戰(zhàn)。1992年Reynolds等[6]從成年鼠的紋狀體和海馬中分離出NSCs, 確定在成熟的中樞神經系統(tǒng)有NSCs的存在。神經損傷后，通過內源性及外源性刺激，促進神經新生，即促進機體自身的NSCs增殖、分化以修復受損的組織是NSCs研究的主要目的[7]。尋找安全有效的藥物來促進自體神經新生一直是NSCs研究者努力的方向。

本研究中我們選擇孕14.5 d的雌鼠，提取其胎鼠的前腦SVZ區(qū)經胰酶消化后獲得NSCs進行培養(yǎng)。如果雌鼠的孕期短于14 d，其胎鼠的腦發(fā)育差，腦體積小，腦組織不飽滿，完整地提取胎鼠前腦的實驗操作難度加大。更重要的是，由于發(fā)育時間短，胎齡過小的胎鼠腦提取出的NSCs數(shù)量少、質量差，難以長期傳代。如果胎齡大于15 d，NSCs已經開始向神經元發(fā)育，NSCs的增殖能力差會影響實驗結果，造成較大實驗偏差。

細胞活性的高低可以反映細胞的增殖能力[8]。細胞增殖速度是衡量細胞增殖的另一項常用指標。本研究中NEAA+β-巰基乙醇組細胞增殖率及增殖速度最高，NEAA組及β-巰基乙醇組高于對照組。說明NEAA和β-巰基乙醇均具有促進NSCs增殖的作用，聯(lián)合作用效果更佳。Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶[9],其裂解活化直接導致細胞死亡[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，1% NEAA和0.1 mmol/L β-巰基乙醇均可降低Caspase-3 mRNA表達，聯(lián)合作用效果更強。提示NEAA和β-巰基乙醇均具有抑制NSCs細胞凋亡的作用。本研究中的β-巰基乙醇組及NEAA+β-巰基乙醇組TUJ-1、GFAP陽性細胞百分比均降低，Nestin陽性細胞百分比升高，以NEAA+β-巰基乙醇組為著，提示β-巰基乙醇具有抑制NSCs向神經元及星形膠質細胞分化的作用，以聯(lián)合應用效果更佳。

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Effects of non-essential amino acids and β-mercaptoethanol on proliferation of neural stem cells

WANGWeiwei1,BAOTianhao,ZHANGHongmiao,WANGShufen,XIAOZhicheng,HANJianhong

(1TheSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650101,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of combined application of non-essential amino acids (NEAA) and β- mercaptoethanol on proliferation of neural stem cells (NSCs). MethodsThe female rats in the gestational age of 14.5 d were selected and executed to extract NSCs and cultivate. We took 5-7 generations of NSCs to do the experiments.The NSCs cultured were divided into four groups: the control group which was added with 12 μL phosphate buffer solution (PBS), the NEAA group which was added with 10 L NEAA and 2 L PBS, the β-mercaptoethanol group which was added with 2 μL β-mercaptoethanol and 10 L PBS, and the NEAA + β-mercaptoethanol group which was added with 10 L NEAA and 2 μL β-mercaptoethanol. The proliferation of NSCs was calculated by cytometry, the proliferation rate of NSCs was detected by MTT, the caspase-3 expression of NSCs was assayed by RT-PCR, and NSCs were identified and examined for the differentiation potential of NSCs into neurons and astrocytes by immunohistochemistry. ResultsCompared with the control group, the proliferation speed and rate of NSCs in the NEAA group were increased, but the caspase-3 mRNA expression of NSCs was decreased (P<0.05 or P<0.01); the proliferation speed and rate of NSCs were increased, but the caspase-3 mRNA expression of NSCs, the percentage of positive ATUJ-1 cells, the percentage of positive GFAP cells were decreased and Nestin was increased in the β-mercaptoethanol group and NEAA+β-mercaptoethanol group (P<0.05 or P<0.01). Significant difference was found in each index between the NEAA group and NEAA+β-mercaptoethanol group (P<0.05 or P<0.01).Compared with the β-mercaptoethanol group, the proliferation speed and rate of NSCs were increased, but the caspase-3 mRNA expression of NSCs was decreased in the NEAA+β-mercaptoethanol group (P<0.05 or P<0.01)ConclusionBoth NEAA and β-mercaptoethanol can promote the proliferation of neural stem cells and they have synergistic effect during the combined application.

Key words:neural stem cells; non-essential amino acids; β-mercaptoethanol; proliferation; differentiation

(收稿日期：2015-11-03)

中圖分類號：R329.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)01-0021-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.007

通信作者簡介：韓劍虹(1969-)，女，副教授，主要從事缺血性腦血管病研究。E-mail:hongjh8@126.com

作者簡介：第一王娓娓(1982-)，女，講師，主要從事老年病、心腦血管病及干細胞研究。E-mail:doctor_b@whu.edu.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(31460314)。