■于建華　周　瑋　王國(guó)棟　任紹潔

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028042；2.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023；3.大連舉揚(yáng)科技有限公司，遼寧大連116023）

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超濾濃縮對(duì)小新月菱形藻活性的影響

■于建華1周瑋2王國(guó)棟3任紹潔1

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028042；2.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023；3.大連舉揚(yáng)科技有限公司，遼寧大連116023）

摘要：試驗(yàn)研究了餌料濃縮機(jī)在不同操作壓力、不同起始密度對(duì)小新月菱形藻（Nitzschiaclos?teriumf.minutissima）進(jìn)行濃縮后細(xì)胞活性的影響。通過(guò)超濾技術(shù)，利用單胞藻餌料濃縮機(jī)對(duì)小新月菱形藻進(jìn)行濃縮，操作壓力為0.10、0.16、0.20 MPa，小新月菱形藻起始密度分別為1.0×106、2.0×106cells/ml，對(duì)不同濃縮時(shí)間的濃縮藻進(jìn)行再培養(yǎng)。結(jié)果表明，小新月菱形藻起始密度1.0×106、2.0×106cells/ml，采用操作壓力分別為0.20 MPa和0.16 MPa時(shí)對(duì)藻細(xì)胞活性影響最小，藻細(xì)胞繁殖速度較快，繁殖密度較大。結(jié)果提示，餌料濃縮機(jī)在合理的壓力下可以對(duì)不同濃度的新月菱形藻進(jìn)行濃縮，不影響藻細(xì)胞的活性。

關(guān)鍵詞：超濾；小新月菱形藻；壓力；活性

小新月菱形藻（Nitzschia closteriumf. minutissi?ma）隸屬于硅藻門(mén)、羽紋綱、管殼縫目、菱形藻科，菱形藻屬，屬于海洋微藻的一種[1]。小新月菱形藻是很多水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物幼體生長(zhǎng)發(fā)育的優(yōu)良餌料，同時(shí)也是很多餌料生物生長(zhǎng)繁殖的最佳餌料[2-5]。目前，微藻的培養(yǎng)、投喂一般與生產(chǎn)育苗同時(shí)進(jìn)行，因而育苗的成敗很大程度上取決于是否提供優(yōu)質(zhì)、充足的微藻。為了解決餌料供應(yīng)問(wèn)題，很多學(xué)者采用超濾濃縮技術(shù)對(duì)單胞藻進(jìn)行濃縮，獲得大量濃縮餌料[6-7]。超濾技術(shù)是一種膜分離技術(shù)。周瑋研究了超濾技術(shù)対金藻的濃縮效果，結(jié)果表明適宜的操作壓力下，濃縮效果明顯，對(duì)金藻活性不產(chǎn)生影響，且操作簡(jiǎn)單、清洗方便[7-9]。但是利用單胞藻餌料濃縮機(jī)對(duì)小新月菱形藻的濃縮方面的研究報(bào)道很少，小新月菱形藻如果在濃縮過(guò)程中藻細(xì)胞遭到破壞，則營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失，失去了應(yīng)用價(jià)值。本試驗(yàn)利用大連海洋大學(xué)研制開(kāi)發(fā)的單胞藻餌料濃縮機(jī)（MFZ-1）對(duì)小新月菱形藻進(jìn)行濃縮，研究了操作壓力和起始密度對(duì)小新月菱形藻細(xì)胞活性的影響，為生產(chǎn)上進(jìn)一步合理利用單胞藻餌料濃縮機(jī)提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

單胞藻餌料濃縮機(jī)(MFZ-1)、顯微鏡（CX21FS1）、血球計(jì)數(shù)板（XB-K-25）。

小新月菱形藻由大連陸源海產(chǎn)科技園單胞藻餌料培養(yǎng)室提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1小新月菱形藻濃縮方法

在不同的餌料培養(yǎng)池中培養(yǎng)小新月菱形藻，使其密度分別達(dá)到1.0×106cells/ml和2.0×106cells/ml，藻液體積為10 m3。試驗(yàn)時(shí)，將濃縮機(jī)進(jìn)藻管口、出藻管口放在餌料池中，將出水管口放入其它空水池中。采用0.10、0.16、0.20 MPa進(jìn)行濃縮，在濃縮過(guò)程中，每隔2 h取樣，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下測(cè)定濃縮藻密度。

1.2.2藻類(lèi)培養(yǎng)及密度測(cè)定方法

藻類(lèi)培養(yǎng)采用f/2培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)[1]。

藻細(xì)胞密度測(cè)定：取濃縮藻液樣品，用15%的福爾馬林溶液固定，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品設(shè)兩個(gè)平行，取平均值。將所取得的濃縮藻（未使用福爾馬林固定）稀釋到1.0×106cells/ml，接種在1 L三角燒瓶中，接種體積300 ml，每瓶加營(yíng)養(yǎng)液0.3 ml，設(shè)3個(gè)平行，搖瓶4次/d，每天下午14：00測(cè)定藻細(xì)胞繁殖密度，取樣2次，取平均值，試驗(yàn)進(jìn)行13 d。未濃縮時(shí)（0 h）藻細(xì)胞繁殖密度作為對(duì)照組。

1.2.3K值計(jì)算

K=(ln Nt-ln N0)/t。

式中：K——相對(duì)生長(zhǎng)常數(shù)(表示生長(zhǎng)效率)；

N0——t時(shí)間開(kāi)始時(shí)的細(xì)胞數(shù)目(×106cells/ml)；

Nt——t經(jīng)過(guò)時(shí)間后的藻細(xì)胞數(shù)目(×106cells/ml);

t——指數(shù)生長(zhǎng)期所經(jīng)歷的時(shí)間（d）。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

采用SPSS11.5軟件進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)，單因素方差分析和Duncan's法多重比較。以P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2　結(jié)果

2.1操作壓力對(duì)小新月菱形藻繁殖的影響

2.1.1起始密度為1.0×106cells/ml濃縮后藻細(xì)胞繁殖情況

操作壓力為0.10 MPa，不同濃縮時(shí)間小新月菱形藻生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖1。由圖1可知，各時(shí)間組的生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組（0 h）無(wú)明顯差異，符合藻類(lèi)一次性培養(yǎng)繁殖規(guī)律。經(jīng)過(guò)指數(shù)增長(zhǎng)期，在第6～7 d藻細(xì)胞密度基本上都達(dá)到了最大值，各濃縮時(shí)間組與對(duì)照組藻細(xì)胞密度差異不顯著（P>0.05）。

操作壓力為0.16 MPa，不同濃縮時(shí)間小新月菱形藻生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖2。由圖2可知，各時(shí)間組藻類(lèi)的繁殖情況與對(duì)照組（0 h）基本一致。濃縮6 h和濃縮8 h組在開(kāi)始培養(yǎng)的第1 d密度稍低于其它各組，出現(xiàn)了延緩期，但是延緩期較短，經(jīng)過(guò)指數(shù)增長(zhǎng)期和相對(duì)生長(zhǎng)下降期后，細(xì)胞密度與其它各組無(wú)明顯差異。在第6 d，藻類(lèi)基本上達(dá)到了最大值[(473.1± 9.3)×104cells/ml]。濃縮8 h組與其它各組在第3 d時(shí)存在差異，細(xì)胞密度為(170.2±2.4)×104cells/ml，低于對(duì)照組[(201.6±11.9)×104cells/ml]。

圖1　0.10 MPa下濃縮時(shí)間對(duì)小新月菱形藻生長(zhǎng)的影響

圖2　0.16 MPa下濃縮時(shí)間對(duì)小新月菱形藻生長(zhǎng)的影響

操作壓力0.20 MPa，不同濃縮時(shí)間小新月菱形藻生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖3。由圖3可知，各時(shí)間濃縮組生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組（0 h）存在著差異，這種變化在藻類(lèi)進(jìn)入靜止期前較為明顯。藻類(lèi)出現(xiàn)了不同程度的延緩期，濃縮8 h組延緩期較其它各組時(shí)間長(zhǎng)，并且指數(shù)增長(zhǎng)期不明顯。濃縮8 h時(shí)間組與對(duì)照組存在著顯著差異(P<0.05)，第7 d時(shí)細(xì)胞密度為(476.8±8.9)×104cells/ml，與對(duì)照組[(490.0±0.1)×104cells/ml]相比差異不顯著。

2.1.2起始密度為2.0×106cells/ml濃縮后藻細(xì)胞繁殖情況

操作壓力0.10 MPa，濃縮時(shí)間對(duì)小新月菱形藻生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，藻類(lèi)在第1～2 d為延緩期，第2～4 d為指數(shù)增長(zhǎng)期，第4～6 d為相對(duì)生長(zhǎng)下降期，第6～9 d為靜止期，第9～13 d為死亡期。各濃縮時(shí)間組與對(duì)照組（0 h）生長(zhǎng)曲線基本相似，0 h時(shí)間組，延緩期較短，其它各組，特別是濃縮8 h組，延緩期較明顯。藻類(lèi)密度在第6 d基本上達(dá)到最大值[（485.7±3.0）×104cells/ml]。

圖3　0.20 MPa下濃縮時(shí)間對(duì)小新月菱形藻生長(zhǎng)的影響

圖4　0.10 MPa下濃縮時(shí)間對(duì)小新月菱形藻生長(zhǎng)的影響

0.16MPa條件下，不同濃縮時(shí)間小新月菱形藻生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖5。由圖5可知，生長(zhǎng)曲線與0.10 MPa相似，濃縮組與對(duì)照組存在著一定的差異，開(kāi)始培養(yǎng)的第1～2 d和第8 d差異不顯著（P>0.05）。第7 d時(shí)，濃縮8 h組的藻細(xì)胞密度低于對(duì)照組（0 h），在第8 d時(shí)，差異不顯著（P>0.05）。

0.20MPa條件下，不同濃縮時(shí)間小新月菱形藻生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖6。由圖6可知，各濃縮時(shí)間組與對(duì)照組其生長(zhǎng)曲線上存在著顯著的差異。濃縮6 h和濃縮8 h組在1～3 d為延緩期，3～6 d為指數(shù)增長(zhǎng)期，6～8 d為相對(duì)生長(zhǎng)下降期，8～11 d為靜止期，11～13 d為死亡期。

圖5　0.16 MPa下濃縮時(shí)間對(duì)小新月菱形藻生長(zhǎng)的影響

圖6　0.20 MPa下濃縮時(shí)間對(duì)小新月菱形藻生長(zhǎng)的影響

濃縮2 h組與對(duì)照組（0 h）無(wú)明顯變化；在進(jìn)入靜止期之前，濃縮6 h組和濃縮8 h組細(xì)胞密度低于對(duì)照組，但是進(jìn)入靜止期后，細(xì)胞密度與對(duì)照組差別不大；濃縮6 h組和濃縮8 h組生長(zhǎng)曲線相似，但是濃縮8 h組各生長(zhǎng)階段的藻細(xì)胞密度始終低于濃縮6 h組。濃縮8 h時(shí)間組顯著低于其它各組（P<0.05）。濃縮8 h組最大密度為(426.0±4.5)×104cells/ml，顯著低于對(duì)照組密度[(489.6±7.3)×104cells/ml]（P<0.05）。

2.2操作壓力對(duì)小新月菱形藻指數(shù)生長(zhǎng)期K值的影響

在不同壓力下，小新月菱形藻指數(shù)生長(zhǎng)期K值變化見(jiàn)表1和表2。由表1可知，隨著濃縮時(shí)間的延長(zhǎng)，K值逐漸變??；隨著壓力的增大，K值逐漸變小。0.20 MPa條件下，濃縮6 h和濃縮8 h時(shí)間組K值明顯低于其它各組。

由表2可知，隨著濃縮時(shí)間的延長(zhǎng)，K值逐漸變?。浑S著壓力的增大，K值逐漸變小。操作壓力0.16 MPa和0.20 MPa，濃縮組K值低于其它各組。

表1　小新月菱形藻在不同壓力下各濃縮時(shí)間組K值（1.0×106cells/ml）

表2　小新月菱形藻在不同壓力下各濃縮時(shí)間組K值（2.0×106cells/ml）

3　討論

在一定的操作壓力下，濃縮小新月菱形藻再培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線與標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)曲線相似（圖1），說(shuō)明藻液在經(jīng)過(guò)濃縮機(jī)濃縮之后，大部分藻細(xì)胞具有活性，能夠繁殖。起使密度為1.0×106cells/ml時(shí)，壓力對(duì)小新月菱形藻的藻細(xì)胞活性影響較小。當(dāng)壓力增加到0.20 MPa時(shí)，隨著濃縮時(shí)間的延長(zhǎng)，藻細(xì)胞再培養(yǎng)后出現(xiàn)了延緩期（圖3），但是延緩期后，藻類(lèi)依然達(dá)到了與對(duì)照組差異不顯著的密度值。藻細(xì)胞是活細(xì)胞，在進(jìn)行濃縮過(guò)程中，細(xì)胞密度不斷增大，藻細(xì)胞可能產(chǎn)生胞外產(chǎn)物，互相抑制生長(zhǎng)，因此再陪養(yǎng)時(shí)，藻細(xì)胞需要在新的培養(yǎng)液中適應(yīng)一段時(shí)間，因而出現(xiàn)延緩期。另外，藻細(xì)胞在濃縮過(guò)程中，壓力越大，濃縮時(shí)間越長(zhǎng)，藻細(xì)胞在超濾膜上堆積的越厚，部分藻細(xì)胞由于擠壓作用，產(chǎn)生一定的損傷，因此在0.20 MPa時(shí)，濃縮8 h組出現(xiàn)了延緩期。但由于小新月菱形藻細(xì)胞外具有硅質(zhì)的細(xì)胞壁[1]，這層硅質(zhì)的細(xì)胞壁對(duì)藻細(xì)胞起到了一定的保護(hù)作用，因此經(jīng)過(guò)了短暫的延緩期之后，藻細(xì)胞密度仍然達(dá)到了很高的值。

藻液起始密度為2.0×106cells/ml時(shí)，隨著壓力的增大，各個(gè)時(shí)間組的藻細(xì)胞再培養(yǎng)時(shí)密度有一定的差異。當(dāng)壓力為0.16 MPa時(shí)，各時(shí)間組的藻細(xì)胞密度在靜止期之前有一定的變化，指數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)速度不同，但經(jīng)過(guò)延緩期和指數(shù)生長(zhǎng)期后，細(xì)胞密度與對(duì)照組差異不顯著(見(jiàn)圖5)。操作壓力為0.20 MPa時(shí)，濃縮6 h和8 h時(shí)間組延緩期較長(zhǎng)，到達(dá)最大密度時(shí)的時(shí)間為9 d，高于對(duì)照組（7 d），且最大細(xì)胞密度值低于對(duì)照組，說(shuō)明藻細(xì)胞在0.20 MPa壓力條件下，超濾膜對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生了影響。藻液在濃縮過(guò)程中，堆積在超濾膜上的藻細(xì)胞不斷增加，如果超濾時(shí)間短，操作壓力低，則堆積速度較慢；相反，操作壓力大，超濾時(shí)間長(zhǎng)，藻細(xì)胞在超濾膜上堆積速度加快，并壓實(shí)，致使部分藻細(xì)胞因機(jī)械損傷而死亡。因此，藻細(xì)胞在8 h濃縮組再培養(yǎng)時(shí)，延緩期增加，由于部分藻細(xì)胞死亡，因此，藻細(xì)胞繁殖速度較低。另外，起始密度較高時(shí)，如果采用較高的壓力，濃縮時(shí)間太長(zhǎng)，小新月菱形藻在濃縮過(guò)程中不斷在超濾膜表面壓實(shí)，濃差極化現(xiàn)象明顯，有可能使超濾膜受到破壞。宮慶禮等[6]研究表明，適宜壓力條件下，濃縮后小球藻的總脂和脂肪酸的組分及含量的化學(xué)成分損失很小。于淑娟等[10]研究表明，在臨界范圍內(nèi)的操作壓力可以減少糖分損失。梁茂雨等[11]、縱偉等[12]指出，適合的操作壓力對(duì)保證黃金梨干酒、黃瓜汁的品質(zhì)是很重要的。本試驗(yàn)結(jié)果表明，合適的操作壓力對(duì)藻細(xì)胞活性影響較小。

4　結(jié)論

利用單胞藻餌料濃縮機(jī)對(duì)小新月菱形藻進(jìn)行濃縮時(shí)，起始密度低，可以采用0.20 MPa進(jìn)行濃縮；起始密度高，如果采用0.20 MPa進(jìn)行濃縮，只有采用短時(shí)間（低于6 h）濃縮才能不破壞細(xì)胞活性，但是，濃縮時(shí)間短，藻細(xì)胞濃縮密度低，達(dá)不到生產(chǎn)要求，因此高密度濃縮時(shí)，采用0.16 MPa進(jìn)行濃縮效果最佳。

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（編輯：劉占，laramie_liu@139.com）

Effects of ultra-filtration concentration on cell activity in Nitzschiaclosterium

Yu Jianhua, Zhou Wei, Wang Guodong, Ren Shaojie

Abstract：The effects of pressure and density on the cell activity in Nitzschia closterium were re?searched in this experiment. The Nitzschia closterium were concentrated under different pressure of 0.10, 0.16 MPa and 0.20 MPa, different initial density of 1.0×106cells/ml and 2.0×106cells/ml to eval?uate the effects of pressure and initial density on survival of the filtered microalgae which were culti?vated again. The results showed that the cells were growing quickly when the pressures were 0.20 MPa and 0.16 MPa. There were no significant differences in cell activity of the concentrated Nitzschiaclos?terium. The results suggested that the Nitzschia closteriubumwhich were concentrated in the reason?able pressure would grow well.

Key words：ultra-filtration；Nitzschiaclosterium；pressure；activity

收稿日期：2015-10-09

通訊作者：周瑋，教授。

作者簡(jiǎn)介：于建華，碩士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料。

中圖分類(lèi)號(hào)：S816.34

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-991X（2016）02-0051-04

doi:10.13302/j.cnki.fi.2016.02.011