姚克兵，張玉軍，王勁根，許 媛，楊敬輝

(江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇 句容 212400)

枯草芽胞桿菌和吡唑醚菌酯協(xié)同防治草莓病害

姚克兵，張玉軍，王勁根，許 媛，楊敬輝*

(江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇 句容 212400)

為了探索化學農(nóng)藥在草莓病害防治上的減量使用，采用枯草芽胞桿菌DJ-6菌株的制劑(BCA)和化學農(nóng)藥吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin，PS)聯(lián)用來協(xié)同防治。用濁度法檢測了DJ-6菌株在不同濃度PS中的敏感性。結果表明，在所有參試的濃度中，DJ-6菌株都能生長。田間防治結果表明，BCA能有效降低PS的使用濃度，BCA單用能防治草莓炭疽病和草莓白粉病，但防效低于PS在標準施用劑量下的防效。然而，BCA與PS聯(lián)用后能減少50 %的PS的施用量。BCA與PS聯(lián)用后能提高DJ-6在草莓葉圍的存活率。兩者聯(lián)用后草莓葉片中過氧化酶、多酚氧化酶、苯丙胺酸裂解酶、β-1,3-葡聚糖酶活性顯著上升了近2倍。

草莓病害；枯草芽孢桿菌DJ-6；吡唑醚菌酯；協(xié)同防治

草莓炭疽病菌(Colletotrichumfragariae)和白粉病菌(Sphaerothecaaphanis)是導致草莓減產(chǎn)的主要病原菌，常年造成10 %～60 %不等的損失[1]。當前國內(nèi)的草莓主栽品種大都高感炭疽病和白粉病，其防治主要依賴于化學藥劑。吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin，PS)屬新型線粒體呼吸抑制劑類殺菌劑[2]，是近年來防治草莓地上部病害的當家藥劑[3]，但由于連年高頻次施用，局部地區(qū)抗藥性水平已相當高，隨著PS在中國專利保護到期，運用PS防治的成本將大大降低，將會有更高頻次和更大范圍的應用，抗藥性暴發(fā)流行的風險增大。加之，吡唑類為中等毒性藥劑，而草莓生產(chǎn)中開花和采果交替進行，因此，該類藥劑在草莓開花后需謹慎使用，需注意殘留毒性對果品安全存在的潛在風險。

先前研究表明，杜鵑內(nèi)生枯草芽胞桿菌DJ-6菌株對多種植物病原菌有很好的頡頏活性，在大棚控制條件下，利用枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis) DJ-6菌株的制劑(BCA)防治草莓枯萎病害是一種有效的途徑[4]。雖然，BCA對葉面病害有很好的防效，但推廣到農(nóng)戶時則防治效果不穩(wěn)定，制約了生防活菌制劑的推廣。

生物和化學協(xié)同防治策略，在減少化學藥劑施用量的同時又能提高生物防治的穩(wěn)定性，但在國內(nèi)運用細菌與化學藥劑協(xié)同防治植物病害的研究報道不多[5-7]。隨著農(nóng)藥化肥“兩減”政策的實施，生物和化學協(xié)同防治方面的研究將成為新的熱點。本文系統(tǒng)研究了BCA與PS的相容性、BCA單用和與化學殺菌劑聯(lián)合使用對草莓炭疽病和白粉病的協(xié)同防控作用，以及協(xié)同使用增效的初步機理。

1 材料與方法

1.1 殺菌劑與培養(yǎng)基

供試殺菌劑。25 %吡唑醚菌酯SC(商品名凱潤，巴斯夫歐洲公司生產(chǎn)，用PS表示)，50 %多菌靈WP(江蘇揚農(nóng)化工集團有限公司生產(chǎn)，用MBC表示)，80 %代森錳鋅(美國陶氏益農(nóng)化工有限公司，用MC表示)。

供試培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基：用于植物病原指示菌的培養(yǎng)。R2A培養(yǎng)基：每1000 mL蒸餾水中含酵母粉0.5 g，酪蛋白胨0.25 g，肉蛋白胨0.25 g，水解酪蛋白0.5 g，葡萄糖0.5 g，淀粉0.5 g，丙酮酸鈉0.3 g，磷酸氫二鉀0.3 g，水合硫酸鎂0.024 g，瓊脂15 g，pH7.2，用于細菌的分離、純化和發(fā)酵種子液的制備。FM培養(yǎng)液：20 L水中含豆粕100 g、馬鈴薯淀粉200 g、蔗糖25 g、酵母粉25 g、碳酸鈣20 g、硫酸錳1.0 g，用于菌種上罐發(fā)酵。

1.2 生防菌劑的制備

1.2.1 菌液的獲得 用無菌牙簽挑取事先在R2A固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)好的DJ-6菌株的單菌落斑，接種于裝有5 mL R2A液體培養(yǎng)基的容積為20 mL的三角瓶中，于30 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)16 h(一級種子培養(yǎng)液)；將所得培養(yǎng)液5 mL全部接種于裝有400 mL R2A培養(yǎng)液的容積為1000 mL的三角瓶中，200 r/min、30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)16 h(二級種子培養(yǎng)液)；把所得的400 mL培養(yǎng)液接種于裝有20 L FM培養(yǎng)液的容積為30 L的發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江東方GUS-30)中，設置發(fā)酵條件為：溶氧100 %，攪拌速度為350 r/min，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間36 h，自動酸堿流加控制在pH為7.0～7.2。

1.2.2 制劑的加工 將1.2.1中的上罐發(fā)酵液離心(8000 r/min)后用20 %丙三醇溶液(V/V)(溶液用無菌水配制)重新懸浮，測定懸浮液的活芽胞含量，根據(jù)測定結果用20 %丙三醇溶液(V/V)調節(jié)懸浮液的活芽胞數(shù)，調節(jié)芽胞終含量約為1.0×1010cfu/mL。在上述調節(jié)好的懸浮液中按5 g/L(W/V)的用量加入黃原膠，并攪拌均勻，得成品懸浮劑的濃度約為100億活芽胞/mL(BCA)，置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DJ-6菌株在不同濃度PS中的生長測定

250 mL三角瓶中加50 mL R2A培養(yǎng)液，設計成PS濃度分別為50、100、150、200和250 mg/L，設不加藥劑(對照)，每個濃度4瓶。每瓶中加入0.1 mL DJ-6二級種子培養(yǎng)液。置30 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)。每間隔6 h在610 nm波長下測定吸光度值，共測定到54 h。

1.4 田間試驗

在田間驗證BCA 和PS單用和/或聯(lián)用對草莓炭疽病和白粉病的防治效果。試驗隨機區(qū)組設計4重復，小區(qū)面積20 m2。試驗處理：C1： PS(500 mL/hm2)； C2：BCA(2.5 L/hm2)；C3：PS(250 mL/hm2)+ BCA(2.5 L/hm2)；C4：MC (1 kg/hm2)；C5：MBC(1 kg/hm2)；C6：水噴霧。供試草莓品種為“紅頰”(高感炭疽病和白粉病)，于草莓移栽50 d始見病后噴霧，用水量為500 L/hm2，隔10 d防治第2次。于第2次防治時記錄病原菌發(fā)病基數(shù)，第2次防治14 d后調查結果并計算防效。炭疽病嚴重度分級標準為：0級，葉片無病斑；1級，病斑直徑<5 mm；2級，病斑直徑6～10 mm；3級，病斑直徑11～15 mm；4級，病斑直徑>15 mm。白粉病的分級標準為：0級，葉片無白粉；1級，白粉面積占葉片總面積的1 %～10 %；2級，白粉面積占葉片總面積的11 %～15 %；3級，白粉面積占葉片總面積的16 %～25 %；4級，白粉面積占葉片總面積的26 %～50 %；5級，白粉面積占葉片總面積50 %以上。每小區(qū)隨機記錄20穴(5點取樣)，每穴取15個老葉(新出的葉片不記錄)。病情指數(shù)按下列公式計算：病情指數(shù)=∑(各級葉片數(shù)×級值)/(調查總葉片數(shù)×最高病級)×100。

1.5 BCA在草莓葉圍的定殖動態(tài)

利用DJ-6菌株對利復平的抗藥性標記，檢測BCA單用和與PS聯(lián)用時在草莓植株上定殖動態(tài)。在施用后不同的間隔期0(接種1 h后)、1、2、3、4、5、6和7 d分別取草莓葉片。取樣葉片浸漬于50 mL 0.1 M pH 7的磷酸緩沖液，180 r/min振蕩30 min。系列稀釋懸浮液，并涂于含100 mg/L利復平的R2A培養(yǎng)基中，3平板每濃度。置30 ℃培養(yǎng)箱，48 h后觀察細菌菌落數(shù)。菌落數(shù)計算成log cfu/g。

1.6 BCA誘導防衛(wèi)相關蛋白的測定

取50日齡的無病健苗移栽于裝有無菌土盆缽中，2苗/缽。移栽30 d后，做如下處理：C1-PS (500 mL/hm2)；C2-BCA (2.5 kg/hm2)；C3-BCA+PS (2.5 kg/hm2+250 mL/hm2)；C4-PS (250 mL/hm2)；CK1-防治處理1 d后再接種炭疽病菌分生孢子懸浮液；CK2-未處理空白對照。每個處理4個重復，6缽/重復。溫室相對濕度在80 %，白天溫度26～28 ℃，晚上溫度20～22 ℃，光暗比為12 h：12 h。接種分生孢子懸浮液的制備：用含1 %吐溫20無菌水將事先在PDA培養(yǎng)基上長好的炭疽病菌分生孢子堆洗下，并充分振蕩，實驗中所用的分生孢子懸浮液濃度是2.56×105孢子/mL。

在接種后0(接種1 h后)、1、3、5、7和9 d取草莓葉片。每個重復取4個單株的葉片組織，取樣葉片樣品用事先預冷的研缽在液氮條件下研磨均勻，置-40 ℃冰箱中保存用于酶活測定。在4 ℃下取1 g葉片研磨樣品加2 mL 0.1 M磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)，在10 000 r/min條件下離心20 min，上清液當作粗酶提取液，過氧化物酶(PO)測定參Hammerschmidt等1982方法[8]，β-1，3-葡聚糖酶參考Pan 等1991方法[9]，多酚氧化酶(PPO)和苯丙胺酸解胺酶(PAL)測定參考Ross等1992方法[10]。

2 結果與分析

2.1 細菌與PS相容性

DJ-6菌株在含不同濃度的PS培養(yǎng)液中都能生長，即使在250 mg/L的濃度條件下也能生長。混濁度隨著培養(yǎng)時間的延長而增大，在不同濃度PS之間生長量差異不顯著，與不加藥劑的空白對照相比，DJ-6菌株在含藥劑的各濃度中生長均有下降但未達顯著水平(圖1)。

2.2 田間防治結果

BCA(2.5 kg/hm2)和PS(250 mL/hm2)聯(lián)用對草莓白粉病和炭疽病的防治效果顯著優(yōu)于二者單用(表1)。BCA加PS聯(lián)用時草莓炭疽病和白粉病的病指分別為2.31和1.98。單用PS和BCA對草莓炭疽病的病指分別為4.46和6.98，而對白粉病的病指分別為2.42和5.75。MC (1kg/hm2)單用對草莓炭疽病和白粉病的病指分別為12.41和10.74。MBC(1 kg/hm2)單用對草莓炭疽病和白粉病的病指分別為15.13和13.76。對照中炭疽病的病指從4.74上升到37.46，而白粉病的病指從2.74上升到23.47。與初始病指相比，BCA和PS單用或聯(lián)用處理中無論是白粉病還是炭疽病的病指相對穩(wěn)定，與空白對照病指相比，所有處理的病指都顯著降低(表1)。

圖1 DJ-6菌株在含不同濃度PS共培養(yǎng)時的生長動態(tài)Fig.1 Growth of Bacillus subtilis (DJ-6) in conjunction with different concentrations of PS

2.3 生防細菌在草莓葉面定殖動態(tài)

在田間草莓上施用7 d后，BCA單用時DJ-6菌株在草莓葉面上的數(shù)量分別從6.95降到2.57 (log cfu /g)。在同一取樣時間段的檢測結果中，BCA與PS聯(lián)用時的細菌種群數(shù)量都高于單用。2個處理中細菌種群數(shù)量都隨著時間的延長而顯著下降(圖2)。

2.4 防衛(wèi)相關蛋白的誘導作用

BCA和PS單用和聯(lián)用后用炭疽病菌分生孢子接種，對草莓植株防衛(wèi)相關蛋白有誘導作用。兩者聯(lián)用后PO、PPO和PAL酶活性高于單用，相比之下對照當中防衛(wèi)相關蛋白質的含量則較低。同樣，在BCA加PS的處理中，抗病相關蛋白β-1，3-葡聚糖酶在炭疽病菌侵染后快速上升，而在健康的對照植株中則表達水平很低(圖3)。上述相關蛋白質的積累都始發(fā)生在炭疽病菌分生孢子接種1 d后。在炭疽病菌分生孢子接種后第5天時防衛(wèi)相關蛋白質上升到最高值，并且在整個9 d的取樣時間里都保持在較高水平，在只接種病原菌而不用生防菌和PS的處理中，防衛(wèi)相關蛋白在最初時段上升，但隨后急劇下降(數(shù)據(jù)未列出)。

表1 PS和BCA對草莓炭疽病和白粉病的防效試驗

注：*同列中相同字母表示處理間差異未達顯著水平(P<0.05)。

Note：* In a column, means followed by a common letter are not significantly different at the 5 % level by DMRT.

圖2 DJ-6和PS混用后在草莓葉圍的定殖動態(tài)Fig.2 Population of Bacillus subtilis (DJ-6) in the strawberry phylloplane as affected by addition of PS

3 討 論

不同濃度PS對枯草芽胞桿菌DJ-6菌株的生長沒有負面影響，即使在高濃度下(250 mg/L)下影響也很小，說明了在生產(chǎn)上由DJ-6菌株加工而成的制劑(BCA)可以和PS聯(lián)用。PS不影響細菌生長的機理，可能是其抑制線粒體呼吸鏈細胞色素b到c的電子傳遞，而這一過程在枯草芽胞桿菌或別的細菌中不存在。

細菌生防制劑和殺菌劑聯(lián)用，為化學殺菌劑的減量施用提供了一個很好的途徑。細菌生防制劑和化學殺菌劑聯(lián)用方面也有類似報道。Kataria等(2002)報道，嘧菌酯低用量與枯草芽胞桿菌聯(lián)用處理種子，對立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKuhn)有很好的增效活性[11]。Sendhil Vel等(2004)報道，嘧菌酯在高濃度下也不影響枯草芽胞桿菌的生長[12]。Kishore 等(2005)報道PseudomonasaeruginosaGSE18和GSE19兩菌株對百菌清(Chlorothalonil)的耐受濃度可高達2000 mg/L，與單用百菌清(2000 mg/L)相比，P.aeruginosaGSE18和百菌清(500 mg/L)聯(lián)用，能有效的減少花生葉斑病，與未處理的對照相比，產(chǎn)量提高了2倍[13]。Kondoh等(2001)報道，用枯草芽胞桿菌 EPS 288菌株和Rb14-C菌株分別與減半的化學殺菌劑聯(lián)用，分別防治對由Penicilliumexpansum引起的梨果病害和西紅柿立枯病的防治效果比單用的高[14]。研究結果也表明，BCA和減半用量的PS對草莓病害的防治效果優(yōu)于二者單用，這一發(fā)現(xiàn)對當前草莓病害綠色防控有重大指導作用。

圖A、圖B、圖C和圖D分別指過氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶和葡聚糖酶在不同處理下的活性。C1指PS (500 mL/hm2)；C2指BCA (2.5 kg/hm2)；C3指BCA+PS (2.5 kg/hm2 +250 mL/hm2)；C4指PS (250 mL/hm2)；CK1指接種炭疽病菌的對照；CK2指未處理對照Fig A, fig B, fig C and fig D represent for the activies of peroxidase, polyphenol oxidase, phenylalanine ammonia-lyase and β-1,3-Glucanase, respectively. C1, PS (500 mL/hm2); C2, BCA (2.5kg/hm2); C3, BCA(2.5kg/hm2) + PS (250 mL/hm2); C4, PS (250 mL/hm2); CK1, inoculated control; CK2, uninoculated control圖3 用BCA和PS處理草莓植株后再用炭疽病菌挑戰(zhàn)接種時防衛(wèi)反應相關蛋白的表達(病原菌接種5d時檢測)Fig.3 Induction of defense enzymes and PR-proteins in strawberry by application of PS and BCA against C.fragirae (5 days after pathogen inculation)

通過BCA和PS聯(lián)用，能提高細菌在葉圍的存活率?？赡艿脑蚴怯捎赑S的存在抑制或減少了其它微生物的競爭，導致葉圍上營養(yǎng)提供相對增加所至。相似的情況發(fā)生在P.aeruginosa與百菌清共用后提高了細菌在葉圍的存活率[13]。

枯草芽胞桿菌控制植物病原菌的作用機制呈多樣性，其主要通過微生境的營養(yǎng)和空間的競爭作用[15]、抗生作用[16]、噬鐵素的產(chǎn)生作用和細胞溶解酶[17-18]。近年來發(fā)現(xiàn)，誘導抗性也是生防細菌重要的生防因子，通過提前施用生防制劑來誘導植物自身的防衛(wèi)反應，抵抗病害的早期侵入，是當前植物病害綜合治理的新策略。

施用BCA提高了草莓植株中防衛(wèi)相關蛋白的活性，并延續(xù)至病原菌接種侵染后的第9天。通過BCA與PS聯(lián)用增強了多種抗病相關酶的活性。在用BCA和PS聯(lián)用的處理中，PAL活性的峰值出現(xiàn)在炭疽病菌接種后的第5天，并且在整個試驗期間一直保持在較高水平，在單獨接種病原菌的植物中，接種4d后酶活性則顯著下降，同樣用BCA加PS處理后草莓植株體內(nèi)的PO和PPO活性顯著上(數(shù)據(jù)未列出)。相似的報道有，Chen等(2000)用P.corrugate處理黃瓜根部后用Pythiumaphanidermatum挑戰(zhàn)接種能檢測到較高的PO和PPO活性[19]。Maurhofer等(1994)報道，用枯草芽胞桿菌引發(fā)的誘導抗性與幾丁質和β-1，3-葡聚糖酶的積累相關[20]。本研究中BCA加PS聯(lián)用處理草莓能誘導β-1，3-葡聚糖酶的增強。綜合以上結果可以得出，BCA單用能誘發(fā)草莓產(chǎn)生系統(tǒng)性抗病性(ISR)，能誘導草莓植株產(chǎn)生多基因抗性，從而有效的抑制多種致病病原菌的侵染。

有關BCA與PS聯(lián)用后植株誘導抗性相關酶活性比BCA單用時高的協(xié)同作用的分子機理還需進行深入的研究。

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(責任編輯 李山云)

Integrated Control of Strawberry Disease Using Biocontrol AgentBacillussubtilisstrain DJ-6 and Pyraclostrobin

YAO Ke-bing, ZHANG Yu-jun, WANG Jing-gen, XU Yuan, YANG Jing-hui*

(Zhenjiang Agricultural Sciences, Hilly Region of Jiangsu, Jiangsu Jurong 212400,Chian)

A combined strategy of strawberry anthracnose and powdery mildew control consisting of reduced fungicide dose and biological control agent with antagonisticBacillussubtilisstrain DJ-6 (BCA)was evaluated. The sensitivity ofB.subtilisstrain DJ-6 to fungicide pyraclostrobin (PS) at different concentrations was tested by turbidometric method. The grown bacterium (DJ-6) was tolerant to all concentrations of PS. In field trials, BCA tested in combination with reduced concentration of PS was highly efficient in management of both diseases of strawberry. Biological control ofColletotrichumfragariaeandSphaerothecaaphaniswith BCA was effective but less than fungicide alone at the standard dose. However, combination of the BCA with a 50 % reduction of PS dose was as effective as the standard fungicide alone. Application of BCA along with PS significantly increased the survival of DJ-6 in the phylloplane of strawberry. Further, there were nearly ‘twofold’ increases in activities of peroxidase, polyphenol oxidase, phenylalanine ammonia lyase and β-1,3-glucanase, in plants treated with BCA plus PS.

Strawberry disease;Bacillussubtilisstrain DJ-6; Pyraclostrobin; Cooperative control

1001-4829(2016)10-2397-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.10.027

2015-12-07

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金[cx(13)3062]；鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科技支撐(NY2013014，NY2015019)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技支撐(BE2013407,BE2015364)

姚克兵(1974-)，男，江蘇鎮(zhèn)江人，碩士，高級農(nóng)藝師,從事植病生防研究，E-mail：yjhnn32@126.com，*為通訊作者。

S668.4

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