劉平平，葉開玉，龔弘娟，王發(fā)明，莫權(quán)輝，蔣橋生，李潔維

(廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006)

獼猴桃60Co-γ射線輻射誘變植株變異的ISSR分子標(biāo)記研究

劉平平，葉開玉，龔弘娟，王發(fā)明，莫權(quán)輝，蔣橋生，李潔維*

(廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006)

分析不同輻射處理后“長果”獼猴桃(Actinidialongicarpa)樣本的變異性，為獼猴桃誘變育種及加快獼猴桃育種進(jìn)程提供理論基礎(chǔ)。采用0 (CK)、40、60、80和100 Gy60Co-γ射線輻射處理“長果”獼猴桃接穗后，用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)5種處理后的55個(gè)樣品的多態(tài)性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：從100條寡聚核苷酸引物中篩選出7條引物進(jìn)行標(biāo)記，平均每條引物擴(kuò)增出14.3條帶，其中6.7條多態(tài)性帶，多態(tài)性比率為46.85 %；遺傳相似系數(shù)為0.79～1.00，聚類分析表明，第Ⅴ類為60Gy 6～8號(hào)植株，與對(duì)照的遺傳距離最遠(yuǎn)，變異程度最大。因此，輻射誘變可導(dǎo)致獼猴桃發(fā)生顯著的遺傳變異，利用ISSR分析方法，可準(zhǔn)確測定輻照樣本是否為突變體。

“長果”獼猴桃；輻射；誘導(dǎo)；變異；ISSR；突變體

輻射誘變具有可以產(chǎn)生小量突變，在改良品種的同時(shí)對(duì)原有優(yōu)異性狀的影響較小等優(yōu)良特性，是離體誘變育種技術(shù)常用的方法之一[1]。目前，輻射誘變最常用最普遍的處理方法是以固定的60Co-γ輻射源裝置一次急性照射試材[2]。突變育種技術(shù)始于20世紀(jì)50年代[1，3]，我國果樹的輻射育種工作始于20世紀(jì)60年代[1-2，4]，目前已在20多種果樹上獲得應(yīng)用[5-6]，并取得較大的成就。輻射誘變?cè)讷J猴桃育種也有相關(guān)報(bào)道。胡延吉等[7]用60Co-γ射線處理2個(gè)獼猴桃品種幼芽選育出2個(gè)各具特色的新品系。

目前，對(duì)輻射誘變分子機(jī)理的研究主要包括兩個(gè)方面：一是以個(gè)別性狀發(fā)生變異的突變體為材料，從分子水平和蛋白質(zhì)水平尋找引發(fā)性狀變異的基因，例如Mao等[8]和Biswas等[9]分別就2個(gè)擬南芥(Arabidopsisthaliana)突變體進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致突變的控制基因；Yan 等[10]研究發(fā)現(xiàn)bc7(t)的脆性突變就是由于OsCesA4基因發(fā)生了堿基刪除造成的。二是利用分子標(biāo)記和蛋白質(zhì)電泳分析DNA變異的研究，可快速準(zhǔn)確的從DNA水平研究輻射誘變效應(yīng)，如李娜等[11]對(duì)誘變粳稻9522篩選出1株帶有白色中脈的隱性單位點(diǎn)突變的Oswm突變體，通過2種分子標(biāo)記最終將導(dǎo)致突變的基因精細(xì)定位在水稻4號(hào)染色體約為122 kb基因上；郭建輝[12-13]等，王陽等[14]，賈月慧等[15]和章寧等[16]應(yīng)用RAPD分子標(biāo)記，分別對(duì)輻照誘變后發(fā)生突變的香蕉新株系漳蕉8號(hào)，花朵變異的百合(Liliumspp. )，9個(gè)亞洲百合(Asiatic lily)‘pollyanna’基因型突變體及蝴蝶蘭(Phalaenopsis hybrid)誘變苗等與原株系對(duì)照，發(fā)現(xiàn)不同的突變體均發(fā)生基因突變；邢莉莉等[17]通過ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)“長紫”輻照后代DNA在不同程度上發(fā)生了變異，且基本上與花型和花色的變異類型相關(guān)。

傳統(tǒng)的獼猴桃選育種途徑主要有：一是從野生獼猴桃種質(zhì)中選育，如國內(nèi)眾多獼猴桃品種；二是從實(shí)生后代中選育，如新西蘭的“海沃德”(Hayward)；三是從雜交后代中選育，如武漢植物所選育的“金艷”(A.chinensis×A.eriantha)。上述3個(gè)育種途徑中，野生優(yōu)株選育最快，但難以獲得突破性的品種；雜交育種和實(shí)生選種雖然可以獲得好品種，但育種周期長，單果種子數(shù)量多，且雄株比例大，難度比其他果樹要大得多。輻射誘變育種是縮短果樹育種周期的有效途徑之一?！伴L果”獼猴桃(A.longicarpa)是由廣西植物研究所發(fā)現(xiàn)的獼猴桃新種，與毛花獼猴桃(A.erianthaBenth.)近緣[18]。具有果皮極易剝離、維生素C含量高、有獨(dú)特的芳香氣味等特點(diǎn)[19]，但果實(shí)偏小。為改良該品種的不良性狀，葉開玉等[20]用4種劑量的60Co-γ射線輻射處理“長果”獼猴桃的枝條，以篩選適宜輻射劑量。本研究在此基礎(chǔ)上對(duì)不同輻射處理后的“長果”獼猴桃樣本進(jìn)行ISSR分子標(biāo)記，分析不同處理、不同個(gè)體在分子水平上是否存在差異，旨在為獼猴桃誘變育種提供理論基礎(chǔ)，加快獼猴桃育種進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試“長果”獼猴桃接穗，采自于廣西植物研究所(桂林市)獼猴桃種質(zhì)圃，20年生嫁接成年樹。于2012年在廣西植物研究所獼猴桃試驗(yàn)場開展田間試驗(yàn)，在廣西植物研究所分子生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 接穗的采集與處理 于樹體休眠期，從長勢中庸的一年生結(jié)果枝，選擇處于休眠狀態(tài)尚未萌動(dòng)的中部飽滿芽，每根枝條留8～10個(gè)側(cè)芽進(jìn)行剪截。每10條接穗為一捆，用濕毛巾包裹保濕，在低溫冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 輻射處理 接穗在廣西南翔環(huán)保有限公司60Co-γ射線輻照中心進(jìn)行輻射處理。設(shè)5個(gè)60Co-γ射線劑量處理：0(CK)、40、60、80和100 Gy；用20 Gy·min-1的劑量率照射。

1.2.3 輻射處理后的嫁接與嫁接后管理 2012年2月25日，在廣西植物研究所實(shí)驗(yàn)場地進(jìn)行露天嫁接，嫁接砧木為一年生美味獼猴桃實(shí)生苗。試驗(yàn)苗木采用單因素隨機(jī)區(qū)組排列種植，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20個(gè)接穗，即20株嫁接苗。接穗嫁接萌芽后，及時(shí)抹除砧木上原有隱芽萌發(fā)后長出的萌蘗，以免與接穗爭奪養(yǎng)分，影響接穗萌發(fā)生長。加強(qiáng)栽培后水肥管理，保證嫁接苗的正常生長，并對(duì)獼猴桃嫁接萌芽率、成活率和形態(tài)變異等進(jìn)行觀測。

1.3 DNA的提取及PCR反應(yīng)條件

1.3.1 獼猴桃總DNA提取與制備 以100 Gy輻射處理的長果獼猴桃嫁接苗成活株數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，分別從不同輻射處理的成活嫁接苗中隨機(jī)選取11株，采集獼猴桃新鮮嫩葉，并對(duì)樣品編號(hào)(編號(hào)取輻射處理的劑量數(shù)值和處理樣品數(shù)，如選取40 Gy處理的11個(gè)接穗，編號(hào)依次為40-1，40-2，40-3…)，嫩葉用于提取DNA。DNA的提取，參照李思光[21]、姚春潮等[22]改良CTAB法，并做了適當(dāng)改進(jìn)，具體如下：①在液氮中把10 mg新鮮獼猴桃葉片研磨成粉末，研磨同時(shí)加入40 mg(6 %，W/V)PVP干粉；②將研磨好的粉末轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，加入700 μl預(yù)冷的提取介質(zhì)(0.2 mol·L-1Tris-HCl，pH8.0；50 mmol·L-1EDTA，pH 8.0；0.25 mol·L-1NaCl)和14 μl β-巰基乙醇，充分混勻后在0 ℃放置10 min。③在4 ℃，7000 r·min-1離心10 min，收集沉淀。④在沉淀中加入700 μl 65 ℃保溫的2×CTAB(2 % CTAB；100 mmol·L-1Tris-HCl，pH8.0；80 mmol·L-1EDTA；1.4 mmol·L-1NaCl，1 % β-巰基乙醇)提取液充分混勻，置于65 ℃水浴1 h，期間每隔10 min輕輕顛倒混勻1次。⑤冷卻后加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)混勻，在4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min。⑥吸取上清液轉(zhuǎn)入新的1.5 mL 離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)混勻，在4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min。⑦吸取上清液轉(zhuǎn)入新的1.5 mL 離心管中，加入2倍體積的無水乙醇，輕輕混勻，在-20 ℃靜置2 h后于10 000 r·min-1離心10 min。⑧棄上清液，沉淀用70 %乙醇漂洗2次，晾干后，溶于100 μl TE中，置于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR反應(yīng)條件 引物選用哥倫比亞大學(xué)(University of British Columbia，Set No.9，No.801-900)公布的序列，共100條，由上海Sangon公司合成。以“長果”獼猴桃總DNA為模板進(jìn)行引物篩選，從100條引物中篩選出7條擴(kuò)增條帶好、信號(hào)強(qiáng)且反應(yīng)穩(wěn)定的引物(表1)，用于“長果”獼猴桃輻射植株ISSR-PCR分析。

PCR反應(yīng)體系：采用20 μl的體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中DNA模板約5 ng，引物0.75 μΜ，2×TaqPCR Master Mix 10 μl，加水補(bǔ)足至20 μl。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，51～53 ℃復(fù)性退火45 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc 2000TM)拍照，保存圖像并觀察記錄。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

電泳圖譜中一條清晰條帶(DNA片段)，代表一個(gè)DNA位點(diǎn)。對(duì)DNA條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，按照條帶的有或無賦值。在相同遷移位置上有帶(顯性)記為1，無帶(隱性)記為0，依此構(gòu)成0/1遺傳相似矩陣。僅在重復(fù)試驗(yàn)中能夠穩(wěn)定出現(xiàn)的DNA條帶用于數(shù)據(jù)分析。得到的二元數(shù)據(jù)矩陣用NTSYS 2.1軟件中SM法計(jì)算遺傳相似系數(shù)，UPGMA法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同輻射劑量處理對(duì)獼猴桃嫁接萌芽率、成活率和形態(tài)變異的影響

接穗嫁接萌芽后，在對(duì)接穗的萌芽率、成活率和形態(tài)變異等觀察中發(fā)現(xiàn)對(duì)照的萌芽個(gè)數(shù)和成活植株數(shù)均最多，分別為59、57，成活率達(dá)95 %；一年生嫁接苗基部直徑最大，為0.92 cm；死亡植株數(shù)最少，死亡率僅5 %；而100 Gy輻射處理后的獼猴桃萌芽個(gè)數(shù)和成活植株數(shù)最少，分別為17、11，成活率僅18.33 %；一年生嫁接苗基部直徑最小，為0.65 cm；死亡植株數(shù)最多，死亡率達(dá)81.67 %，而形態(tài)變異植株比例高達(dá)81.81 %(表1)。在100 Gy的輻射劑量范圍內(nèi)，隨著輻射劑量的增加，死亡植株數(shù)相應(yīng)增加；而萌芽個(gè)數(shù)、成活植株數(shù)、形態(tài)變異植株數(shù)和一年生嫁接苗基部直徑相應(yīng)減少，說明輻射處理對(duì)“長果”獼猴桃芽的萌發(fā)、植株成活率、植株形態(tài)變異和一年生嫁接苗基部直徑等均有一定的影響。根據(jù)成活植株的外觀形態(tài)變異可為確定“長果”獼猴桃適宜輻射劑量為60～80 Gy。

2.2 獼猴桃輻射誘變嫁接植株ISSR引物篩選與多態(tài)性分析

利用優(yōu)化的反應(yīng)體系，從100條ISSR引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定性強(qiáng)的7條引物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用7條引物對(duì)55個(gè)“長果”獼猴桃總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如表2所示，共擴(kuò)增出100個(gè)DNA位點(diǎn)，其中約47個(gè)為多態(tài)性位點(diǎn)，占總位點(diǎn)的46.85 %。其中U820的DNA條帶數(shù)和多態(tài)位點(diǎn)數(shù)最多，分別為17和13，其次是U835和U853，DNA條帶數(shù)均為15，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)分別為9、8，U846和U847的DNA條帶數(shù)均為14，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)分別為5、6，U825和U845的DNA條帶數(shù)偏少，依次為13、12，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)依次為1、5。不同劑量輻射處理后多態(tài)位點(diǎn)數(shù)以60 Gy最多，為46，平均多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為6.6，其次為80和40 Gy，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)分別為34和33，平均多態(tài)位點(diǎn)數(shù)分別為4.9和4.7，100 Gy處理后多態(tài)位點(diǎn)數(shù)最少，為30，平均多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為4.3。結(jié)合形態(tài)變異植株數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)與形態(tài)變異數(shù)相關(guān)性不大。

從引物U846的部分PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖1)可以看出，60-7，60-8沒有大于1.1 kb的DNA條帶，而80-6和80-7有2條，經(jīng)輻射誘導(dǎo)的“長果”獼猴桃植株ISSR擴(kuò)增的帶紋豐富，ISSR反應(yīng)擴(kuò)增的條帶分子量一般均為400～1500 bp。

表1 不同輻射劑量處理對(duì)獼猴桃嫁接萌芽率、成活率和形態(tài)變異的影響

表2 7條ISSR引物序列及擴(kuò)增結(jié)果

Note：Y=(C，T)，R=(A，G).

2.3 聚類分析

利用ISSR-PCR擴(kuò)增的116條DNA條帶建立遺傳相似矩陣，按UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建55個(gè)“長果”獼猴桃輻射樣品的聚類圖(圖2)。在遺傳相似系數(shù)0.79～1.00的聚類結(jié)果顯示，7個(gè)ISSR引物能將供試的55個(gè)樣品分開。依據(jù)遺傳相似性程度，在遺傳相似系數(shù)為0.83時(shí)，可將55個(gè)“長果”獼猴桃植株聚為5類。第Ⅰ類中包含未經(jīng)輻射處理的CK-1～CK-11，40-1～40-11和60-1～60-5共27個(gè)樣品，40-1～40-3與對(duì)照的遺傳距離最近，變異程度最小，其次為40-5～40-11和60-1～60-3，60-4和60-5與對(duì)照遺傳距離最遠(yuǎn)；第Ⅱ類為100-1～100-11和80-11；第Ⅲ類為80-1～80-10和60-9～60-11；第Ⅳ類為40-4單株；60-6～60-8為第Ⅴ類，與對(duì)照的遺傳距離最遠(yuǎn)，變異程度最大。聚類分析結(jié)果表明40、60、80和100 Gy輻射處理后遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生變異的株數(shù)分別為1、5、11、11，隨著輻射劑量增加，變異植株數(shù)也相應(yīng)增加，這與形態(tài)觀察結(jié)果一致。聚類分析結(jié)果與形態(tài)觀察結(jié)果比較顯示，100 Gy輻射處理后形態(tài)上發(fā)生變異株數(shù)有9株，而聚類結(jié)果顯示11株，說明遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生變異不一定從外觀形態(tài)上表現(xiàn)出來。

M：100 bp DNA marker；1～5：60-7～60-11；6～14：80-1～80-9圖1 引物U846擴(kuò)增的部分長果獼猴桃ISSR電泳圖Fig.1 The ISSR electrophoretic figure of partial primer U846‘Changguo’kiwifruit

3 討 論

本研究中，在0～100 Gy的輻射劑量內(nèi)，隨著輻射劑量的增加，植株存活逐漸減少，變異程度逐漸增大，萌芽個(gè)數(shù)、成活植株數(shù)和一年生嫁接苗基部直徑逐漸減少，這與郭建輝等[12]研究結(jié)果一致。Luckey等[23]研究認(rèn)為，小劑量或適宜劑量輻射對(duì)生物體有刺激效應(yīng)，高劑量射線對(duì)植物生長活性酶起抑制作用。80 Gy以上，植株畸形嚴(yán)重，主要表現(xiàn)在枝條分化和葉片的性狀上，枝條節(jié)間縮短或不分節(jié)，葉片表現(xiàn)簇生、失綠發(fā)黃、不對(duì)稱畸形或皺縮畸形、缺刻等癥狀；這與Luckey等的研究結(jié)果基本一致。成活植株的外觀形態(tài)變異也可為確定獼猴桃適宜輻射劑量提供依據(jù)。結(jié)果同時(shí)認(rèn)為，“長果”獼猴桃最佳輻射劑量為60～80 Gy；再次驗(yàn)證了葉開玉等[21]前期試驗(yàn)結(jié)果，即“長果”獼猴桃半致死劑量為71.7 Gy的結(jié)論?？梢?，60Co-γ射線誘導(dǎo)“長果”獼猴桃發(fā)生變異程度具有穩(wěn)定性。

根據(jù)ISSR電泳圖譜分析，與對(duì)照相比，60Co-γ射線處理使獼猴桃的遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生變異，主要表現(xiàn)為ISSR擴(kuò)增差異條帶的增加或者減少，可能是基因組中相關(guān)位點(diǎn)堿基變化的結(jié)果。這也可能是導(dǎo)致植株的形態(tài)發(fā)生變異的原因。不同引物擴(kuò)增得到的DNA條帶數(shù)不同，條帶數(shù)越多，相應(yīng)的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)也越多，且多態(tài)性位點(diǎn)多分布在較大或是較少DNA片段，而不同劑量輻射處理中以60 Gy多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)最多，60 Gy以上反而略有降低，而形態(tài)變異發(fā)現(xiàn)100 Gy處理的變異植株比例最多。結(jié)合聚類結(jié)果分析，40-4、60-6、60-7、60-8幾個(gè)單株與對(duì)照的遺傳距離最遠(yuǎn)，變異程度最大，說明在變異植株中，這幾個(gè)單株本身可能特有的突變位點(diǎn)最多，從而也說明了60 Gy多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)較多的原因，而100 Gy處理的變異植株雖然最多，但是多為變異植株共有的。

圖右邊數(shù)字代表不同處理樣品編號(hào)Number in right figure represented different samples圖2 基于ISSR數(shù)據(jù)繪制的55份供試材料間的聚類分析Fig.2 The clustering analysis of 55 samples according to ISSR data

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，60Co-γ射線誘變可以造成獼猴桃遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。根據(jù)輻射處理后的嫁接苗在形態(tài)和生長方面等的表型變化情況，在一定程度上可進(jìn)行輻射遺傳變異的預(yù)測和評(píng)估。利用ISSR分析方法，可準(zhǔn)確測定輻照樣本情況，從中選擇基因變異且性狀良好的突變體作為選育新品種的目標(biāo)，同時(shí)確定適宜的輻射誘變劑量，為輻射誘變育種提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

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(責(zé)任編輯 溫國泉)

Study on ISSR Molecular Marker of Kiwifruit Mutational Plant Induced by60Co-γ Ray

LIU Ping-ping, YE Kai-yu, GONG Hong-juan, WANG Fa-ming, MO Quan-hui, JIANG Qiao-sheng, LI Jie-wei*

(Guangxi Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Guangxi Guilin 541006, China)

In order to provide theoretical base for kiwifruit mutation breeding and speed up the breeding process， the variability among irradiation-treated kiwifruit ‘Changguo’ samples were analyzed. The branches of kiwifruit ‘Changguo’ from 55 samples were irradiated by60Co-γ ray in 0 (CK), 40, 60, 80 and 100 Gy, respectively. The polymorphism of these 5 treatments were analyzed using ISSR molecular marker technology. The results showed that 7 screened primers were used for marking from 100 oligonucleotide primers. The average amplified fragment was 14.3, and the polymorphic bands number was 6.7. The polymorphic ratio was 46.85 %. Calculated genetic similarity coefficient was from 0.79 to 1.00. Clustering analysis suggested that the Ⅴclass was 6-8 plants of 60Gy, which the genetic distance was the farthest, and the variation was the largest compared with others. Large genetic variation in kiwifruit was induced by irradiation. It is accurate to measure whether irradiation samples are mutants using ISSR for mutant cultivar.

‘Changguo’ kiwifruit; Radiation; Induction; Variation; ISSR; Mutant

1001-4829(2016)10-2457-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.10.038

2016-05-07

廣西自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2011GXSFA018092)；廣西科技攻關(guān)項(xiàng)目(桂科攻10100006-4A、桂科能14121008-1-14)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系廣西創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)專項(xiàng)(nycytxgxcxtd-03-13)；廣西植物研究所科學(xué)研究基金項(xiàng)目(桂植業(yè)12007)

劉平平(1987-)，女，廣西全州人，研究實(shí)習(xí)員，碩士，主要從事植物病理學(xué)研究，E-mail：fhlpp001@126.com,*為通訊作者，E-mail：lijw@gxib.cn。

S663.4

A