吳麗敏，陳立祥，梁麗娟，王　箏，王　淼，劉少偉，熊云昭，王　萱，許慶友

( 1．河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，河北石家莊　050091;2．河北中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院內(nèi)科教研室，河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病重點實驗室，河北石家莊　050091)

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依普利酮下調(diào)SGK-1表達抑制梗阻性腎病細胞增殖的研究

吳麗敏1，2，陳立祥1，梁麗娟1，王箏2，王淼1，劉少偉2，熊云昭1，王萱1，許慶友1，2

( 1．河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，河北石家莊050091;2．河北中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院內(nèi)科教研室，河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病重點實驗室，河北石家莊050091)

關(guān)鍵詞:依普利酮;腎間質(zhì)纖維化;細胞增殖; UUO; PCNA; SGK-1; TGF-β1

許慶友( 1958－)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向:腎臟病中西醫(yī)結(jié)合臨床及基礎(chǔ)，通訊作者，Tel: 0311-89926298，E-mail: qingyouxu@ sohu．com

腎間質(zhì)纖維化( RIF)是各種慢性腎臟疾病發(fā)展到終末期腎衰竭的共同病理改變［1］。其主要病理特點為臟器萎縮、細胞外基質(zhì)( ECM)過度積聚和細胞增生。研究表明，血清糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶1( SGK-1)、轉(zhuǎn)化生長因子β1( TGF-β1)等致纖維化因子在醛固酮的誘導(dǎo)下促進細胞增殖及ECM積聚，造成腎臟硬化［2－3］。

本實驗采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎梗阻大鼠模型，激活腎素-血管緊張素-醛固酮( RAAS)系統(tǒng)，誘導(dǎo)醛固酮活化致腎間質(zhì)纖維化。觀察其阻斷劑依普利酮對細胞增殖標志物增殖細胞核抗原( PCNA)、血清糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶1( SGK-1)、轉(zhuǎn)化生長因子β1( TGF-β1)的調(diào)控作用，探討依普利酮拮抗醛固酮活化所致腎間質(zhì)纖維化的可能作用機制。

1　材料與方法

1．1實驗動物及分組選用清潔級♀Wistar大鼠36只，體質(zhì)量( 200±20) g，購自河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，隨機分為假手術(shù)組、UUO組及依普利酮組( n =12)。

1．2藥物、試劑和主要儀器依普利酮為美國Pfizer公司產(chǎn)品，日本Research Diets．Inc公司根據(jù)動物進食量及藥物用量( 100 mg·kg－1·d－1)按1. 25 g·kg－1加入飼料中; PCNA抗體選用Epitomics產(chǎn)品; SGK-1抗體選用Affbiotech產(chǎn)品; TGF-β1、GAPDH抗體均選用Bioworld Technology產(chǎn)品;電泳儀及電泳槽(北京六一公司)，OLYMPUS VANOX PM-10AD型顯微照相儀(日本OLYMPUS公司)，LEICA RM 2245型石蠟切片機(德國LEICA上海分公司)。

1．3造模方法及給藥實驗動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，復(fù)制梗阻性腎病模型，10%水合氯醛注射麻醉，于腹部左側(cè)切開，游離左側(cè)輸尿管，于輸尿管上1/3處和中1/3處結(jié)扎后切斷并縫合，假手術(shù)組僅游離輸尿管。治療組給以大鼠依普利酮100 mg·kg－1·d－1。治療10 d后摘取左側(cè)腎臟，4%多聚甲醛中固定、石蠟包埋，切片行常規(guī)HE、Masson及免疫組化染色;剩余組織－70℃保存用于Western blot檢測蛋白表達。

1．4觀察指標及方法

1．4．1 HE、Masson染色觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)改變

1．4．2免疫組化檢測PCNA、SGK-1、TGF-β1表達采用SABC法檢測，一抗?jié)舛染鶠?∶100。

1．4．3 Western blot檢測PCNA、SGK-1、TGF-β1蛋白表達冰凍腎組織100mg加裂解液(含蛋白酶抑制劑) 0. 4 mL，提取蛋白并測定含量;取樣品上樣蛋白20μg，電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，加入一抗SGK-1、PCNA、GAPDH抗體( 1∶1000)，TGF-β1抗體( 1∶500)，4℃過夜，清洗3次，加入兔二抗( 1∶20 000)孵育后顯影，與所得內(nèi)參進行校正后比較。

1．5統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)資料結(jié)果采用SPSS17. 0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析( Oneway ANOVA)，數(shù)值變量以±s表示。

2　結(jié)果

2．1各組大鼠腎臟組織病理學(xué)改變HE染色結(jié)果假手術(shù)組腎臟偶見炎性細胞浸潤，間質(zhì)無水腫，小管無擴張，上皮細胞排列整齊; UUO組大鼠腎臟有大量炎性細胞浸潤，腎小管擴張明顯，上皮細胞脫落;依普利酮組遠端小管擴張程度及上皮細胞脫落與UUO組大致相同，但炎性細胞浸潤較UUO組明顯減少( Fig 1)。Masson染色結(jié)果:假手術(shù)組大鼠腎臟間質(zhì)中可見少量膠原纖維成分表達，腎小管和腎小球基底膜結(jié)構(gòu)清晰。UUO組腎小管間質(zhì)中有大量膠原纖維成分沉積，腎臟結(jié)構(gòu)紊亂。依普利酮組膠原纖維成分表達與假手術(shù)組相比增多，與UUO組相比膠原纖維成分明顯減少( Fig 2)。

2．2腎組織PCNA的免疫組化檢測PCNA在假手術(shù)組中僅有少量表達，見于腎小管。模型組陽性細胞明顯增多，以腎小管上皮細胞及間質(zhì)表達為甚;依普利酮組與模型組相比，PCNA陽性細胞數(shù)明顯減少，主要見于腎小管( Fig 3)。

2．3腎組織SGK-1及TGF-β1的表達假手術(shù)組SGK-1及TGF-β1呈弱表達，主要表達于腎小管上皮細胞，SGK-1以遠端小管為主;模型組中SGK-1及TGF-β1表達明顯增強，主要見于腎小管上皮及間質(zhì)細胞:依普利酮組SGK-1及TGF-β1表達范圍及強度較模型組均明顯減弱( Fig 4、5)。

Fig 1 HE staining of kidney in rats with UUO(×200)

Fig 2 Masson staining of kidney in rats with UUO(×200)

Fig 3 Expression of PCNA in UUO rats with immunohistochemistry (×200)

Fig 4 Expression of SGK-1 in UUO rats with immunohistochemistry(×100)

Fig 5 Expression of TGF-β1in UUO rats with immunohistochemistry(×200)

2．4腎組織PCNA、SGK-1及TGF-β1的蛋白表達

采用Western blot檢測腎組織PCNA、SGK-1及TGF-β1蛋白表達，結(jié)果顯示模型組PCNA、SGK-1及TGF-β1表達與假手術(shù)組相比明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P＜0. 01) ;依普利酮組的表達與模型組相比明顯減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P＜0. 05)，見Tab 1、Fig 6。

Tab 1 The protein expression of PCNA，SGK-1，TGF-β1in UUO rats with Western blot (±s，n =3)

Tab 1 The protein expression of PCNA，SGK-1，TGF-β1in UUO rats with Western blot (±s，n =3)

＊＊P＜0. 01 vs sham;△P＜0. 05 vs UUO

Group　PCNA/GAPDH　SGK-1/GAPDH　TGF-β1/GAPDH Sham　0．4579±0．0458　0．4608±0．1561　0．0826±0．0166 UUO　1．1113±0．1922＊＊　1．5957±0．2680＊＊　0．7216±0．0792＊＊Epl　0．6479±0．2075△　1．0605±0．2224△　0．3 680±0．0656△

Fig 6 Expression of PCNA，SGK-1，TGF-β1in UUO rats with Western blot

3　討論

慢性腎衰竭是所有慢性腎臟疾病發(fā)展的最終結(jié)局，其病理改變是腎間質(zhì)纖維化。腎間質(zhì)纖維化常伴有腎小管萎縮、間質(zhì)炎性細胞浸潤、成纖維細胞聚集以及間質(zhì)基質(zhì)沉積等特征性病理改變。隨著對RAAS系統(tǒng)的深入了解，研究證實RAAS的激活是引起慢性腎臟病的重要因素之一［4］，醛固酮作為RAAS系統(tǒng)的重要效應(yīng)分子，可作為獨立危險因素直接參與慢性腎臟疾病的進展［5］。新的研究發(fā)現(xiàn)，醛固酮除可調(diào)節(jié)腎臟電解質(zhì)及水的排泄外，也參與炎性損傷、氧化應(yīng)激、膠原沉積等多種病理反應(yīng)［6］。細胞增殖及ECM的沉積是導(dǎo)致腎小球硬化和間質(zhì)纖維化的重要因素之一。細胞增殖多出現(xiàn)在ECM沉積之前，并持續(xù)存在于ECM的沉積及腎間質(zhì)纖維化發(fā)展過程中［7］，故抑制醛固酮活化誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞及間質(zhì)細胞增殖作用可相對減少ECM的沉積，減緩腎間質(zhì)纖維化進程，對于減緩慢性腎臟病的進展具有重大意義。

PCNA在腎臟病的進展中反映著細胞的增殖狀態(tài)，有研究表明UUO術(shù)后3d腎臟PCNA表達明顯增強［8］，我們的研究也發(fā)現(xiàn)梗阻24 h后PCNA陽性細胞開始增多并持續(xù)于整個實驗(結(jié)果待發(fā)表)，主要以上皮細胞及間質(zhì)細胞為主，增殖的細胞分泌細胞外基質(zhì)參與纖維化的進展。故有效抑制細胞增殖對減緩腎間質(zhì)纖維化具有重要作用。

細胞增殖與多種血管活性物質(zhì)及細胞生長因子等有關(guān)，以往對Ang II較為重視，近幾年通過對醛固酮的深入研究，醛固酮活化在腎臟病的損傷中有著更為重要的意義，醛固酮活化的作用途徑有多種，其中SGK-1途徑在炎性損傷中發(fā)揮著重要作用。SGK-1的經(jīng)典作用是對腎小管中鈉離子代謝的調(diào)節(jié)。此外SGK-1是重要的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及細胞磷酸化級聯(lián)反應(yīng)的功能性交匯點，研究表明醛固酮可刺激SGK-1介導(dǎo)腎臟炎癥反應(yīng)及纖維化［9］。在梗阻性腎病大鼠實驗中，醛固酮活化誘導(dǎo)SGK-1在腎組織中表達增強［10－11］，導(dǎo)致氧化應(yīng)激、炎性損傷，并上調(diào)促纖維化因子CTGF的表達，引起MMPs/TIMPs的失衡，加速臟器纖維化進程［12］。故SGK-1目前被認為是醛固酮促臟器纖維化、氧化應(yīng)激及炎性損傷的主要效應(yīng)介質(zhì)［13］。亦有研究表明梗阻性腎病動物中腎小管上皮細胞的表型轉(zhuǎn)化與SGK-1的上調(diào)密切相關(guān)，敲除SGK-1基因可減輕UUO誘導(dǎo)的細胞表型轉(zhuǎn)化［11］。SGK-1主要參與細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，與NF-кB的活化密切相關(guān)，有研究提示醛固酮可通過SGK-1誘導(dǎo)大鼠系膜細胞促纖維化因子CTGF分泌及NF-κB的活化［14］。醛固酮活化誘導(dǎo)的炎性損傷可通過SGK-1/NF-κB信號通路促纖維化，故SGK-1在醛固酮促纖維化中發(fā)揮著重要作用［15］。本研究主要觀察醛固酮誘導(dǎo)的細胞增殖以及信號傳導(dǎo)，結(jié)果顯示梗阻性腎病誘導(dǎo)的醛固酮活化通過SGK-1通路刺激腎小管上皮細胞增殖，參與纖維化的進展，給予依普利酮治療后，細胞增殖得以抑制，其作用與下調(diào)SGK-1相關(guān)。

此外，經(jīng)典途徑TGF-β1作為重要的致纖維化細胞生長因子，對細胞增殖的作用依然存在，其高表達是Ang II還是醛固酮誘導(dǎo)尚需進一步證實，但通過抑制醛固酮活性，可以同時下調(diào)其表達，抑制細胞的增殖，減輕纖維化病變。

新型鹽皮質(zhì)激素受體阻斷劑依普利酮與螺內(nèi)酯相比，具有高度選擇性，可競爭性抑制鹽皮質(zhì)激素受體與醛固酮的結(jié)合，從而阻止醛固酮受體復(fù)合物的形成及活化所誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化進程。對腎臟具有一定的保護作用［9、16］。已有實驗證實，依普利酮可有效抑制醛固酮的活化，抑制細胞增殖和細胞外基質(zhì)過度分泌，保護腎功能［17－18］。本實驗主要通過采用UUO方式復(fù)制腎間質(zhì)纖維化模型，激活RAAS系統(tǒng)，誘導(dǎo)醛固酮活化上調(diào)SGK-1表達介導(dǎo)腎小管上皮細胞增殖作用，研究其阻斷劑依普利酮可通過下調(diào)SGK-1表達抑制梗阻性腎病細胞增殖從而達到減輕腎間質(zhì)纖維化的作用。之前我們曾觀察依普利酮通過下調(diào)TNF-α、NF-κB抑制細胞表型轉(zhuǎn)化，減輕腎間質(zhì)纖維化的作用［16］，這次研究以細胞增殖為重點，觀察醛固酮活化上調(diào)SGK-1表達對細胞增殖標記物增殖細胞核抗原( PCNA)的作用。結(jié)果顯示依普利酮可通過下調(diào)SGK-1、TGF-β1的表達，抑制細胞的增殖及ECM的沉積，從而減緩腎間質(zhì)纖維化的進程，減輕腎臟損傷。

(致謝:衷心感謝河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病重點實驗室各位老師的支持與幫助。)

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Inhibitory effects of eplerenone on cell proliferation via down-regulated SGK-1 pathway in rats with unilateral ureteral obstruction

WU Li-min1，2，CHEN Li-xiang1，LIANG Li-juan1，WANG Zheng2，WANG Miao1，LIU Shao-wei2，XIONG Yun-zhao1，WANG Xuan1，XU Qing-you1，2
( 1．Hebei Medical University Graduate School，Shijiazhuang 050091，China; 2．College of Integrated Chinese and Western Medicine，Hebei University of Chinese Medicine，Hebei Key Laboratory of Integrative Medicine on Liver-kidney patterns，Shijiazhuang 050091，China)

Abstract:AimTo observe the effect of mineralocorticoid receptor blockade eplerenone on cell proliferation in obstructed kidney of rats．Methods Renal interstitial fibrotic animals were made with unilateral ureteral obstruction ( UUO) and treated with eplerenone100 mg ·kg－1·d－1．The kidneys were harvested on the 10th day and proliferating cell nuclear antigen ( PCNA)，serum and glucocorticoid induced kinase-1 ( SGK-1) and transforming growth factor-β1 ( TGF-β1) were detected with immunohistochemistry and Western blot．ResultsRenal histopathology showed large quantities extracellular matrix ( ECM) accumulation in kidney with UUO，large numbers of inflammatory cells infiltrated in renal interstitium，renal tubular expansion and exfoliation of epithelial cells．The cell proliferation and ECM accumulation were inhibited in eplerenone treated rats significantly．Immunohistochemistry and Western blot showed that expressions of PCNA，SGK-1 and TGF-β1were significantly up-regulated with UUO and down-regulated by eplerenone．ConclusionEplerenone plays the role in inhibiting the cell proliferation and reducing ECM accumulation by down-regulating expression of SGK-1 pathway in rats with unilateral ureteral obstruction．

Key words:eplerenone; renal interstitial fibrosis; cell proliferation; UUO; PCNA; SGK-1; TGF-β1

作者簡介:吳麗敏( 1989－)，女，碩士生，研究方向:腎臟病中西醫(yī)結(jié)合臨床及基礎(chǔ)，Tel: 0311-89926298，E-mail: 916952722 @ qq．com;

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目( No 81273684，81473652)，河北省自然科學(xué)基金資助項目( No H2015423009)

收稿日期:2015－09－06，修回日期: 2015－11－26

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0069－05中國圖書分類號: R－332; R322．61; R341; R692．39; R977. 6摘要:目的觀察鹽皮質(zhì)激素受體阻斷劑依普利酮抑制梗阻性實驗動物腎臟細胞增殖的作用及機制。方法結(jié)扎大鼠單側(cè)輸尿管( UUO)制備腎間質(zhì)纖維化動物模型，給予依普利酮100 mg·kg－1·d－1治療，10 d后摘取腎臟，觀察大鼠腎臟組織病理改變。采用免疫組化、Western blot方法檢測增殖細胞核抗原( PCNA)、血清糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶1 ( SGK-1)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1( TGF-β1)的表達。結(jié)果腎臟病理顯示，UUO組大鼠腎臟有明顯的細胞外基質(zhì)( ECM)積聚，有大量炎性細胞浸潤，腎小管擴張明顯，上皮細胞脫落，依普利酮可明顯減輕其細胞增殖及ECM的沉積;免疫組化和Western blot結(jié)果顯示，UUO組大鼠腎臟PCNA、SGK-1、TGF-β1表達明顯增強;依普利酮可下調(diào)其表達。結(jié)論依普利酮可通過下調(diào)SGK-1的表達，抑制梗阻性腎病細胞增殖，減少ECM的沉積，減緩腎臟纖維化的進程，減輕腎臟損傷。

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．015