汪宏錦，王紅玉，何　然，吳俊杰，徐曉玉

(西南大學(xué)藥學(xué)院＆中醫(yī)藥學(xué)院，重慶市藥效評價工程技術(shù)研究中心，西南大學(xué)中藥研究所，重慶　400715)

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灰氈毛忍冬花蕾提取物及其兩種主要皂苷的溶血性研究

汪宏錦，王紅玉，何然，吳俊杰，徐曉玉

(西南大學(xué)藥學(xué)院＆中醫(yī)藥學(xué)院，重慶市藥效評價工程技術(shù)研究中心，西南大學(xué)中藥研究所，重慶400715)

中國圖書分類號: R-332; R282．71; R284．1; R331．122; R973

摘要:目的評價灰氈毛忍冬花蕾提取物、灰氈毛忍冬皂苷乙與川續(xù)斷皂苷乙的體內(nèi)外溶血作用。方法采用肉眼觀察法和紫外分光光度法，觀察灰氈毛忍冬花蕾提取物、灰氈毛忍冬皂苷乙與川續(xù)斷皂苷乙濃度梯度為5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mg·L－1的溶液在體外對2%兔紅細(xì)胞懸浮液的溶血反應(yīng);采用血液生化指標(biāo)測定方法，分別檢測灰氈毛忍冬花蕾提取物2. 275 g·kg－1(生藥)和1. 137 g· kg－1(生藥)組、灰氈毛忍冬皂苷乙0. 110 g·kg－1和0. 055 g ·kg－1組、川續(xù)斷皂苷乙0. 020 g·kg－1和0. 010 g·kg－1組以及生理鹽水組，在小鼠尾靜脈給藥前及連續(xù)給藥7 d后，血液中紅細(xì)胞數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量。結(jié)果在體外溶血試驗中，各給藥組溶血率均＜5%，與對照組相比均未見明顯的溶血現(xiàn)象( P＞0. 05) ;在體內(nèi)溶血試驗中，各組小鼠用藥前后，血液紅細(xì)胞數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量均處于正常范圍內(nèi)，且其數(shù)值在給藥前后無差異( P＞0. 05)。結(jié)論在本試驗條件下，灰氈毛忍冬花蕾提取物、灰氈毛忍冬皂苷乙與川續(xù)斷皂苷乙，在體外和體內(nèi)試驗均未導(dǎo)致溶血。

關(guān)鍵詞:灰氈毛忍冬花蕾;灰氈毛忍冬皂苷乙;川續(xù)斷皂苷乙;溶血;肉眼觀察法;分光光度法

徐曉玉( 1958－)，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:中藥藥理與新藥開發(fā)，通訊作者，Tel: 023-68250765，E-mail: xuxiaoyu@ swu．edu．cn

灰氈毛忍冬( Lonicera macranthoides Hand．－Mazz．)系忍冬科忍冬屬的植物，其花蕾為《中華人民共和國藥典》2005版以來收載的山銀花藥材第一植物來源。灰氈毛忍冬花蕾性甘、寒;歸肺、心、胃經(jīng)，有清熱解毒，疏散風(fēng)熱的功效［1］，具有抑菌抗病毒［2－4］、解熱抗炎［5－7］、保肝利膽［8－9］、免疫調(diào)節(jié)［4］

等藥理作用，有很大的臨床藥用價值。灰氈毛忍冬花蕾的主要化學(xué)成分為有機(jī)酸類、皂苷類、黃酮類等，其中所含皂苷以灰氈毛忍冬皂苷乙( macranthoidinB，mB)和川續(xù)斷皂苷乙( dipsacosideB，dB)最具代表性［10］。因為其含量豐富，兩種皂苷的總含量通常達(dá)到5%以上，目前被作為2010年版《中華人民共和國藥典》區(qū)別于忍冬的主要鑒定成分。

研究顯示，部分藥材的皂苷在血管內(nèi)給藥時具有溶血的特點(diǎn)［11］。1984年貴州省藥材公司王玉英等在《中藥材科技》第2期上曾報道過“灰氈毛忍冬蒸曬品無溶血性，而生曬品有溶血性。如作注射液原料，必須采用蒸曬品”［12］。自此，灰氈毛忍冬一直被認(rèn)為具有溶血作用，但課題組查遍了近30年來能查到的所有資料，未見任何有關(guān)灰氈毛忍冬溶血性的其他報道。為了弄清這一問題的客觀情況，本試驗采用2種方法，對灰氈毛忍冬花蕾提取物及其所含的兩種主要皂苷(灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙)是否具有溶血特性，在體內(nèi)外進(jìn)行了研究，以期為灰氈毛忍冬花蕾的正確認(rèn)識和合理使用提供參考。

1　儀器與材料

1．1儀器EL204電子天平(上海梅特勒－托利多儀器有限公司)，7DL-40B普通離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，UV3010紫外分光光度計(日本高新)，SHH-150L生化培養(yǎng)箱(重慶永生試驗儀器廠)，XSZ-H雙目生物顯微鏡(重慶光電)等。

1．2動物新西蘭大白兔10只，♀♂各半，體質(zhì)量2～3 kg( SPF級，質(zhì)量合格證號: 0003225) ; KM小鼠70只，♀♂各半，體質(zhì)量18～22 g( SPF級，質(zhì)量合格證號: 0003222)。兩種動物均購于重慶市中藥研究院實(shí)驗動物研究所(生產(chǎn)許可證號: 2012-0006)。飼養(yǎng)于西南大學(xué)藥學(xué)院SPF級實(shí)驗動物中心(實(shí)驗動物使用許可證號: SYXK(渝) 2009-0002)。

1．3試劑與藥品自制灰氈毛忍冬花蕾提取物，灰氈毛忍冬干燥選花花蕾來源于重慶秀山，批號: 20140628，經(jīng)西南大學(xué)齊紅藝教授鑒定為忍冬科忍冬屬植物灰氈毛忍冬的干燥花蕾。該花蕾的產(chǎn)地加工方法為:采用蒸汽殺青熱風(fēng)干燥機(jī)( JYH150型，重慶市農(nóng)科院農(nóng)機(jī)研究所研制生產(chǎn))加工，采收24h內(nèi)120℃蒸汽殺青5 min，80℃干燥35 min。將灰氈毛忍冬花蕾粉碎，過60目篩，稱取一定量粉末于錐形瓶中，加適量70%乙醇，物料比為1∶8，70℃下回流提取4. 5 h，抽濾，濾液真空冷凍干燥得到提取物，備用。1 g提取物相當(dāng)于生藥量187. 5 g。

灰氈毛忍冬皂苷乙標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%，上海源葉生物科技有限公司，ZM0510BC13) ;川續(xù)斷皂苷乙標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%，上海源葉生物科技有限公司，KS0905CA14) ;紅細(xì)胞稀釋液測試盒( 100 mL/瓶，C037)、網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)液(含網(wǎng)織紅細(xì)胞染色儲備液，16mL/瓶;網(wǎng)織紅細(xì)胞染色稀釋液，60 mL/瓶，C043)及氰化高鐵血紅蛋白測試盒( 1 mL/支，C021)，均購于南京建成生物工程研究所;蒸餾水、生理鹽水等。

2　方法

2．1體外溶血試驗

2．1．1體積分?jǐn)?shù)0. 02的紅細(xì)胞懸浮液制備心臟取血法取兔血2～3 mL，放入燒杯中用脫脂棉球棒輕微攪拌5～10 min，除去纖維蛋白原，使之成為脫纖血液。加入0. 9%氯化鈉溶液約10倍量，搖勻，1 200 r·min－1離心15 min，除去上清液，沉淀的紅細(xì)胞再用0. 9%氯化鈉溶液按上述方法洗滌2～3次，至上清液不顯紅色為止。將所得紅細(xì)胞溶液用0. 9%氯化鈉溶液配成體積分?jǐn)?shù)0. 02的紅細(xì)胞混懸液(每100 mL混懸液含紅細(xì)胞溶液2 mL)，待用［13］。

2．1．2供試溶液制備分別用灰氈毛忍冬花蕾提取物( hH)、灰氈毛忍冬皂苷乙( mB)、川續(xù)斷皂苷乙( dB)標(biāo)品以生理鹽水配成100 mg·L－1的母液，再用生理鹽水稀釋成5、10、20、30、40、50、60、70、80、90 mg·L－1的梯度濃度溶液，備用。

2．1．3肉眼觀察法3種藥物每種分別取潔凈試管13只，進(jìn)行編號: 1號管為陰性對照管(生理鹽水)，2號管為陽性對照管(蒸餾水)，3～13號管為供試品管(不同濃度藥物)。每管均加入2%紅細(xì)胞懸液2. 5 mL后，1號管再加入生理鹽水2. 5 mL，2號管再加入蒸餾水2. 5 mL，3～13號管再分別加入生理鹽水2. 2 mL和不同濃度的受試物0. 3 mL，使每管溶液總量均為5 mL?；靹蚝?，立即置于37℃± 0. 5℃的恒溫箱中進(jìn)行溫育，開始每隔15 min觀察1次，1 h后，每隔1 h觀察1次，觀察3 h。

2．1．4分光光度法①最大吸收波長的確定:取蒸餾水2. 5 mL，加入2%紅細(xì)胞懸液2. 5 mL，混勻，置于37℃恒溫水浴箱中保溫30 min后，取出后離心5 min( r =1 500 r·min－1)，吸取上清液在紫外分光光度計上掃描，以0. 9%氯化鈉溶液為對照，確定最大吸收波長為545 nm［13－14］。②離心時間及轉(zhuǎn)速的確定:取生理鹽水2. 5 mL，加入2%紅細(xì)胞懸液2. 5 mL作為陰性對照，37℃溫育30 min，分別以1 500、2 000、2 500、3 000 r·min－1的轉(zhuǎn)速離心5、10、15 min，取上清液于最大吸收波長545 nm處測定吸光度［14］。結(jié)果見Fig 1?？梢?，吸光度隨時間以及轉(zhuǎn)速的增加呈下降趨勢，故確定離心時間為5 min，轉(zhuǎn)速為3 000 r·min－1( Fig 1)。③檢測步驟: 3種藥物分別取潔凈試管13只，進(jìn)行編號，1號管為陰性對照管(生理鹽水)，2號管為陽性對照管(蒸餾水)，3～13號管為供試品管(不同濃度藥物)。每管均加入2%紅細(xì)胞懸液2. 5 mL后，1號管再加入生理鹽水2. 5 mL，2號管再加入蒸餾水2. 5 mL，3～13號管再分別加入生理鹽水2. 2 mL和不同濃度的受試物0. 3 mL，使每管溶液總量均為5 mL。混勻后，立即置于37℃±0. 5℃的恒溫箱中進(jìn)行溫育，開始每隔15 min觀察1次，1 h后，每隔1 h觀察1次，觀察3 h。3 h后將各管溶液離心，取上清，在分光光度計上，最大吸收波長處以生理鹽水為空白讀取各管的OD值。④結(jié)果判斷:用下式計算各試驗管的溶血率%。

溶血率/% = ( ODt－ODnc) /( ODpc－ODnc)× 100%。式中，ODt:試驗管吸光度; ODnc:陰性對照管吸光度; ODpc:陽性對照管吸光度。參考評價標(biāo)準(zhǔn):溶血率＞5%表明有溶血發(fā)生［13］，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。

Fig 1 Absorbance changes in different rotate speed and centrifugation time

2．2體內(nèi)溶血試驗

2．2．1動物分組及給藥KM小鼠70只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進(jìn)行隨機(jī)分組。設(shè)灰氈毛忍冬花蕾提取物2. 275 g·kg－1(生藥量)組，1. 137 g·kg－1(生藥量)組;灰氈毛忍冬皂苷乙0. 110、0. 055 g·kg－1組;川續(xù)斷皂苷乙0. 020、0. 010 g·kg－1組;生理鹽水組。每組10只。提取物以生理鹽水分別稀釋成75. 8、37. 9 g·L－1;灰氈毛忍冬皂苷乙以生理鹽水分別稀釋成3. 60、1. 80 g·L－1;川續(xù)斷皂苷乙以生理鹽水分別稀釋成0. 66、0. 33 g·L－1。尾靜脈給藥［0. 1 mL·( 10 g)－1·d－1［15］］，連續(xù)給藥7 d。

2．2．2紅細(xì)胞計數(shù)參考文獻(xiàn)方法［16］，于給藥前，末次給藥后30 min斷尾取血，準(zhǔn)確吸取10 μL，將其加入2 mL稀釋液中，充分混勻，用計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)。

2．2．3網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)參考文獻(xiàn)方法［16］，于給藥前，末次給藥后30 min斷尾取血，處理，顯微鏡下觀察，用計數(shù)板計數(shù)1 000個紅細(xì)胞中網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)目。

2．2．4血紅蛋白含量測定參考文獻(xiàn)方法［16］，于給藥前，末次給藥后30 min斷尾取血，準(zhǔn)確吸取10 μL，加入到2. 5 mL HICN稀釋液中，回洗3次，混勻后靜置5 min，分光光度計用蒸餾水調(diào)零，540 nm處測定各管吸光度A值，血紅蛋白含量( g·L－1) = A×367. 7。

2．3統(tǒng)計處理方法溶血指標(biāo)的檢查結(jié)果統(tǒng)計采用百分率表示;所有試驗均重復(fù)3次。試驗數(shù)據(jù)用SPSS 17. 0軟件進(jìn)行單因素方差分析，統(tǒng)計結(jié)果以±s表示。

Tab 1 Hemolysis test of extracts from Lonicera macranthoides flower bud in vitro( visual inspection and Spectrophotometry test)

Tab 2 Hemolysis test of macranthoidinB in vitro( visual inspection and Spectrophotometry test)

Tab 3 Hemolysis test of DipsacosideB in vitro( visual inspection and Spectrophotometry test)

Tab 4 Average values of RBC，RET and MCHC before and after mice respectively treated with extracts from Lonicera macranthoides flower bud，MacranthoidinB and DipsacosideB(±s，n =10)

Tab 4 Average values of RBC，RET and MCHC before and after mice respectively treated with extracts from Lonicera macranthoides flower bud，MacranthoidinB and DipsacosideB(±s，n =10)

Group　RBC/1012·L－1RET/%MCHC/g·L－1pre-dose　post-dose NS　9．37±0．47　9．45±0．39　2．88±0．61　2．78±0．93　2 pre-dose　post-dose pre-dose　post-dose 02．36±9．33　193．45±9．29 hH 2．275 g·kg－1　8．87±0．87　8．57±0．47　3．22±0．45　3．12±0．34　185．83±18．82　170．46±20．98 hH 1．137 g·kg－1　9．06±0．87　8．63±0．63　3．16±0．42　3．23±0．51　157．37±18．29　159．43±19．06 mB 0．110 g·kg－1　9．22±0．47　8．72±0．92　2．69±0．43　2．75±0．37　167．96±10．56　166．71±12．69 mB 0．055 g·kg－1　10．37±0．55　8．40±0．90　2．75±0．33　2．84±0．28　178．37±11．68　156．64±11．62 dB 0．020 g·kg－1　8．86±0．75　8．51±0．41　2．91±0．52　2．88±0．34　173．95±8．84　170．35±18．85 dB 0．010 g·kg－1　8．58±0．64__________ 8．32±0．57___________3_________________________________ ．38±0．37_2．98±0．42_160．86±19．15______ 168．68±______14．35

3　結(jié)果

3．1體外溶血試驗結(jié)果結(jié)果表明，灰氈毛忍冬花蕾提取物( hH)、灰氈毛忍冬皂苷乙( mB)與川續(xù)斷皂苷乙( dB)的各濃度體外溶血試驗中，均未觀察到溶血現(xiàn)象;各給藥組致體外紅細(xì)胞溶血率均低于5%，也無明顯的劑量依存關(guān)系。見Tab 1、2、3。按照《中藥、天然藥物局部刺激性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的判定標(biāo)準(zhǔn)，體外紅細(xì)胞溶血率低于5%說明無溶血發(fā)生［13］。

3．2體內(nèi)溶血試驗結(jié)果灰氈毛忍冬花蕾提取物( hH)、灰氈毛忍冬皂苷乙( mB)與川續(xù)斷皂苷乙( dB)的體內(nèi)溶血試驗表明，供試物對小鼠血液學(xué)指標(biāo)無明顯影響，給藥前與給藥后各組小鼠的紅細(xì)胞數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量平均值均在正常范圍(紅細(xì)胞數(shù): 7. 7～12. 5×1012·L－1;網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù): 2. 15%～5. 87%;血紅蛋白: 100～210 g· L－1)［16］，見Tab 4。

4　討論

4．1皂苷溶血性與糖鏈數(shù)目、苷元種類及基團(tuán)酸堿性等有關(guān)皂苷導(dǎo)致溶血，多是因為皂苷能與膽固醇結(jié)合生成不溶性的分子復(fù)合物［17］。當(dāng)皂苷水溶液與紅細(xì)胞相接觸時，紅細(xì)胞壁上的膽固醇與皂苷結(jié)合，生成不溶性的復(fù)合物沉淀，血紅細(xì)胞的正常滲透性遭到破壞，使紅細(xì)胞內(nèi)滲透壓增加而發(fā)生崩解，從而導(dǎo)致溶血現(xiàn)象［18］。皂苷溶血活性還和糖鏈數(shù)目有關(guān)，許多雙糖鏈皂苷無溶血作用，但單糖鏈皂苷溶血作用明顯［19］。但并非所有皂苷都具有溶血現(xiàn)象，例如以含三萜皂苷為主的人參總皂苷沒有溶血作用，但經(jīng)過分離后，其中以原人參三醇及齊墩果酸為苷元的人參皂苷則具有明顯的溶血作用，而以人參二醇為苷元的人參皂苷則具有抗溶血作用［17］。另外，皂苷的溶血性也與皂苷中所含基團(tuán)酸堿性有關(guān)，酸性皂苷溶血作用大于中性皂苷［20－21］。灰氈毛忍冬皂苷乙與川續(xù)斷皂苷乙均為常春藤皂苷元的雙糖鏈皂苷，理論上不具有溶血作用。

4．2有關(guān)“灰氈毛忍冬皂苷具有溶血作用”問題查無實(shí)據(jù)歷史的有關(guān)報道并沒有涉及到皂苷問題。1984年貴州省藥材公司王玉英等在《中藥材科技》第2期報道有關(guān)研究結(jié)果的全文如下“①五種材料的LD50順序為:密銀花＜濟(jì)銀花＜(灰氈毛忍冬)蒸曬品＜(灰氈毛忍冬)生曬品＜貴州商品?？梢娀覛置潭亩拘噪m較密銀花、濟(jì)銀花稍大，但蒸曬品或生曬品均小于貴州山銀花，因而是安全的。②灰氈毛忍冬蒸曬品無溶血性，而生曬品有溶血性。如作注射液原料，必須采用蒸曬。③對灰氈毛忍冬的蒸曬品與生曬品進(jìn)行比較，前者的毒性比后者小;前者無溶血性而后者有溶血性。故產(chǎn)地加工應(yīng)采用蒸曬法?！痹撐闹饕獜?qiáng)調(diào)加工規(guī)范，沒有將灰氈毛忍冬的兩種皂苷與溶血性相聯(lián)系，沒有進(jìn)行任何成分、機(jī)制方面的研究。近30年來也未見類似報道，有關(guān)灰氈毛忍冬皂苷具有溶血作用的問題查無實(shí)據(jù)。

4．3本試驗結(jié)果未發(fā)現(xiàn)灰氈毛忍冬及其兩種主要皂苷的溶血作用本研究采用山銀花野生資源保護(hù)地，亦是山銀花最大種植加工生產(chǎn)地——重慶秀山所產(chǎn)灰氈毛忍冬為研究對象。該縣自2006年以來在全縣推廣使用特別研制的銀花產(chǎn)地加工“蒸汽殺青熱風(fēng)干燥機(jī)”，目前有蒸汽殺青熱風(fēng)干燥機(jī)148臺覆蓋全縣30．1萬畝種植基地，藥材加工規(guī)范，質(zhì)量統(tǒng)一，具有代表性。本研究以《中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的指導(dǎo)原則》為規(guī)范，進(jìn)行了體外試驗，分光光度法與肉眼觀察法結(jié)果均表明，灰氈毛忍冬花蕾提取物、灰氈毛忍冬皂苷乙與川續(xù)斷皂苷乙在一定濃度范圍內(nèi)( 5～100 mg·L－1)均沒有溶血作用，且查閱文獻(xiàn)未發(fā)現(xiàn)有報道三萜皂苷溶血作用與濃度有關(guān)。在模擬溶血反應(yīng)長期毒性試驗方法進(jìn)行給藥7 d的體內(nèi)溶血試驗中，各給藥組給藥前后紅細(xì)胞數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量均處于正常范圍內(nèi)［16］，且各組給藥前后的數(shù)值沒有差異性( P＞0. 05)。由此得出，經(jīng)產(chǎn)地蒸汽殺青后干燥(或蒸曬法)加工制成的灰氈毛忍冬花蕾混合提取物，以及灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙均不會導(dǎo)致溶血。

(致謝:本試驗在西南大學(xué)藥學(xué)院分子藥理實(shí)驗室、重慶市藥效評價工程技術(shù)研究中心和西南大學(xué)中藥研究所完成。感謝實(shí)驗室各位老師的幫助與支持! )

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On hemolysis of extracts of Lonicera Macranthoides flower bud and two saponins

WANG Hong-jin，WANG Hong-yu，HE Ran，WU Jun-jie，XU Xiao-yu
( College of Pharmaceutical Sciences，Southwest University，Chongqing Engineering Research Center for Pharmacodynamics Evaluation，Chongqing 400715，China)

Abstract:AimTo figure out whether Lonicera macranthoides could induce hemolysis．Methods In vitro，macroscopic observation and spectrophotometry were used to observe whether the solutions of extracts from Lonicera macranthoides，MacranthoidinB and DipsacosideB could induce hemolysis in 2% red cell suspension of New Zealand white rabbits．And the three tested materials were prepared in concentration gradient of 5，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100 mg· L－1; and in vivo，mice were respectively treated with MacranthoidinB ( 0. 110 g·kg－1，0. 055 g·kg－1)，DipsacosideB( 0. 020 g·kg－1，0. 010 g·kg－1)，extracts ( 2. 275 g·kg－1，1. 137 g·kg－1，crude drugs) once per day for 7 days，and all of the tested doses depended on the clinical doses．Then，RBC，RET and MCHC before and after administration were tested．ResultsThe hemolytic ratio in each treated group was below 5% in vitro．And in vivo，the three materials did not induce hemolysis and had no significant influence on RBC，RET and MCHC( P＞0. 05)．Conclusions Extracts from flower bud of Lonicera macranthoides，MacranthoidinB and DipsacosideB，have not caused hemolysis in vivo and in vitro in this research．

Key words:flower bud of Lonicera macranthoides; MacranthoidinB; DipsacosideB; hemolysis; visual inspection; spectrophotometry test

作者簡介:汪宏錦( 1994－)，男，研究方向:中藥藥理與新藥開發(fā)，E-mail: sudazxwhj@ live．com;

基金項目:重慶市應(yīng)用開發(fā)計劃項目( No cstc2014yykkfA80023) ;重慶市121科技示范工程( No cstc2014fazktjcsf80038) ;秀山金銀花產(chǎn)業(yè)開發(fā)項目。

收稿日期:2015－09－14，修回日期: 2015－11－29

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0043－06

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．010