劉孝峰

嵊州市人民醫(yī)院中藥房，浙江 紹興 312400

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HPLC法同時測定定喘止咳糖漿中5種成分的含量

劉孝峰

嵊州市人民醫(yī)院中藥房，浙江 紹興 312400

[摘要]目的建立高效液相色譜法同時測定定喘止咳糖漿中苦杏仁苷、和厚樸酚、厚樸酚、橙皮苷和川陳皮素含量的方法。方法采用依利特C18柱，流動相為乙腈(A)-0.2%冰醋酸溶液(B)，梯度洗脫；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：λ1=210 nm(苦杏仁苷)，λ2=254 nm(和厚樸酚、厚樸酚)，λ3=283 nm(橙皮苷、川陳皮素)。結(jié)果苦杏仁苷、和厚樸酚、厚樸酚、橙皮苷、川陳皮素的線性范圍分別為12.10～242.00 μg/mL(r=0.999 8)、7.65～153.00 μg/mL(r=0.999 3)、6.37～127.40 μg/mL(r=0.999 7)、4.29～85.80 μg/mL(r=0.999 9)、3.90～78.00 μg/mL(r=0.999 2)；5種成分的平均加樣回收率(n=6)分別為98.62%、96.94%、99.17%、96.85%、97.84%，RSD分別為0.88%、1.12%、1.10%、1.04%、1.55%。結(jié)論定喘止咳糖漿中5種成分的含量測定方法準(zhǔn)確、可靠。

[關(guān)鍵詞]高效液相色譜法；定喘止咳糖漿；苦杏仁苷；和厚樸酚；厚樸酚；橙皮苷；川陳皮素

0引言

定喘止咳糖漿是由苦杏仁、厚樸、陳皮、麻黃、柴胡、紫蘇葉、甘草7味中藥組成的中藥復(fù)方制劑，該制劑的功效為宣肺平喘、理氣止咳，主要治療風(fēng)寒喘咳、胸腹脹滿，也用于支氣管哮喘、支氣管炎等病癥的治療[1-2]，對預(yù)防流行性感冒有顯著的臨床療效。原部頒的定喘止咳糖漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對處方中麻黃所含的鹽酸麻黃堿進(jìn)行了薄層定性鑒別，未對該方中相關(guān)組分進(jìn)行定量研究，對該制劑的定量研究也未見報道，但僅1味藥材定性并不能有效控制該制劑的質(zhì)量和療效，本研究對該制劑中苦杏仁、厚樸、陳皮3味藥材中的5個成分(苦杏仁苷、和厚樸酚、厚樸酚、橙皮苷、川陳皮素)進(jìn)行定量方法學(xué)研究，為定喘止咳糖漿的全面質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器安捷倫1200型HPLC色譜儀，G1315B可變波長檢測器；VS-100UE型恒溫超聲波提取機(jī)(無錫沃信儀器有限公司)。十萬分之一電子天平(Mettlertoledo XS205DU)。

1.2試藥苦杏仁苷對照品(批號：110820-201305，含量以85.8%計)、和厚樸酚對照品(批號：110730-201313，含量以100%計)、厚樸酚對照品(批號：110729-200412，含量以100%計)、橙皮苷(批號：110721-201316，含量以95.3%計)均由中國食品藥品檢定研究院提供；川陳皮素(478-01-3，含量以98.0%計)購于上海純優(yōu)生物科技有限公司；定喘止咳糖漿(100 mL/瓶，批號：141012、141125、150109)購于河南禹州市藥王制藥有限公司；乙腈為色譜純，冰醋酸為分析純，水為重蒸餾水。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗色譜柱：依利特C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.2%冰醋酸溶液(B)，按表1進(jìn)行梯度洗脫[3-9]；檢測波長(0～29 min，λ1=210 nm[10-13]；29～50 min，λ2=254 nm[14-15]；50～70 min，λ3=283 nm[16-19])；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。此系統(tǒng)條件下所測組分與其他組分分離效果良好，理論塔板數(shù)按川陳皮素計不得低于3 000，分離度均>2.0。

表1　流動相梯度洗脫程序

2.2溶液的制備

2.2.1對照品儲備液的制備分別稱取苦杏仁苷、和厚樸酚、厚樸酚、橙皮苷和川陳皮素對照品適量，分別加70%甲醇溶解并稀釋，制成苦杏仁苷、和厚樸酚、厚樸酚、橙皮苷、川陳皮素質(zhì)量濃度分別為1.210、0.765、0.637、0.429、0.390 mg/mL的單一成分的對照品儲備液。

2.2.2混合對照品溶液的制備分別吸取“2.2.1”項下各對照品儲備液6.5、6.0、5.0、5.0、1.5 mL，用70%甲醇稀釋，制成每1 mL含苦杏仁苷、和厚樸酚、厚樸酚、橙皮苷、川陳皮素分別為157.3、91.8、63.7、42.9、11.7 μg的混合對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備精密量取定喘止咳糖漿4.0 mL，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液46 mL，并稱定總重量，記錄具體數(shù)據(jù)，采用超聲波對樣品進(jìn)行超聲處理20 min，取出后自然放至室溫，稱定，用70%甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.2.4陰性對照溶液的制備按照《中藥成方制劑》第十三冊定喘止咳糖漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的處方工藝，分別制備苦杏仁空白樣品、厚樸空白樣品和陳皮空白樣品?？瞻讟悠钒凑瘴闹小?.2.3”項下供試品溶液的制備方法，分別制備苦杏仁空白溶液、厚樸空白溶液和陳皮空白溶液。

2.3專屬性實驗分別精密吸取供試品溶液、混合對照品溶液、苦杏仁空白溶液、厚樸空白溶液、陳皮空白溶液，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖，按保留時間先后設(shè)置出峰順序：苦杏仁苷、和厚樸酚、厚樸酚、橙皮苷、川陳皮素，供試品溶液和混合對照品溶液所測各組分保留時間一致；苦杏仁空白溶液色譜圖未見苦杏仁苷色譜吸收峰；厚樸空白溶液色譜圖未見和厚樸酚、厚樸酚吸收峰，陳皮空白溶液色譜圖未見橙皮苷、川陳皮素吸收峰，結(jié)果表明，處方中其他成分對所測成分無干擾。色譜圖見圖1～圖5。

圖1　對照品色譜圖

圖2　供試品色譜圖

2.4線性關(guān)系考察分別精密吸取“2.2.1”項下對照品儲備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，分別置10 mL量瓶中，并用70%甲醇稀釋成系列濃度的混合對照品溶液。按上述色譜條件測定，以峰面積A為縱坐標(biāo)、對照品質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計算，結(jié)果見表2。

圖3　苦杏仁空白溶液色譜圖

圖4　厚樸空白溶液色譜圖

圖5　陳皮空白溶液色譜圖

組分回歸方程線性范圍(μg/mL)r苦杏仁苷A=1.0253×106C+512.412.10～242.000.9998和厚樸酚A=8.6134×105C+216.77.65～153.000.9993厚樸酚A=5.9735×105C-196.56.37～127.400.9997橙皮苷A=4.3384×105C+307.24.29～85.800.9999川陳皮素A=3.9672×105C-299.83.90～78.000.9992

2.5精密度試驗精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液20 μL，按上述色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄5種成分的峰面積，計算各成分RSD：苦杏仁苷為0.83%，和厚樸酚為0.97%，厚樸酚為1.34%，橙皮苷為1.09%，川陳皮素為1.62%。

2.6重復(fù)性試驗按樣品含量測定方法對同一批號的6份樣品進(jìn)行測定，記錄峰面積，計算RSD。結(jié)果顯示，苦杏仁苷為0.38%，和厚樸酚為0.79%，厚樸酚為1.25%，橙皮苷為1.02%，川陳皮素為1.37%，表明重復(fù)性良好。

2.7溶液的穩(wěn)定性試驗取定喘止咳糖漿(批號：150109)的供試品溶液1份，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，計算各組分的RSD?？嘈尤受盏腞SD為0.61%，和厚樸酚為0.94%，厚樸酚為1.27%，橙皮苷為0.82%，川陳皮素為1.84%，結(jié)果表明，24 h內(nèi)供試品溶液具有良好的穩(wěn)定性。

2.8加樣回收率試驗取6份已知含量的定喘止咳糖漿(苦杏仁苷為1.972 mg/mL，和厚樸酚為1.131 mg/mL，厚樸酚為0.804 mg/mL，橙皮苷為0.543 mg/mL，川陳皮素為0.149 mg/mL)適量，精密量取2.0 mL，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入混合對照品溶液25 mL、70%甲醇溶液25 mL，按“2.1”項下操作，取續(xù)濾液，過濾，作為加樣供試品溶液。按上述色譜條件測定，計算各組分回收率。上述5個成分的平均加樣回收率(n=6)分別為98.62%、96.94%、99.17%、96.85%、97.84%，RSD分別為0.88%、1.12%、1.10%、1.04%、1.55%。

2.9樣品測定取3個批號的定喘止咳糖漿樣品，照“2.2.3”項下制備供試品溶液，按上述色譜條件測定苦杏仁苷、和厚樸酚、厚樸酚、橙皮苷和川陳皮素的含量，結(jié)果見表3。

表3　樣品含量測定結(jié)果(mg/mL)

3討論

3.1提取溶劑與提取方法通過對加熱回流、不同時間(10、20、30 min)超聲提取及不同濃度提取溶劑(40%甲醇、70%甲醇和甲醇)進(jìn)行比較試驗，確定供試品溶液制備的最佳條件：70%甲醇，超聲提取20 min。

3.2流動相的選擇筆者嘗試應(yīng)用甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.2%冰醋酸溶液進(jìn)行試驗，對比基線平穩(wěn)和分離效果，最終確定以乙腈-0.2%冰醋酸為流動相進(jìn)行梯度洗脫。

3.3多指標(biāo)的質(zhì)量評價模式需要消耗大量對照品，對生產(chǎn)檢驗成本控制和實際質(zhì)量監(jiān)督評價存在一定影響，因此，該制劑能否采用一測多評法控制質(zhì)量還有待進(jìn)一步研究。

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Simultaneous determination of amygdalin,honokiol,magnolol,hesperidin and nobiletin in dingchuanzhike syrups by HPLCLIU Xiao-feng (Pharmacy of TCM,Shengzhou People′s Hospital,Shaoxing 312400,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish an HPLC method for the simultaneous determination of 5 main components(amygdalin,honokiol,magnolol,hesperidin and nobiletin) in dingchuanzhike syrups.MethodsA stable HPLC method was established and the chromatography was accomplished on an Hypersil C18column,with a mobile phase of acetonitrile(A) and 0.2% glacial acetic acid solution(B) in a gradient elution.The flow rate was 0.8 mL/min.The column temperature was set at 30 ℃.Amygdalin was detected at 210 nm,honokiol and magnolol were detected at 254 nm,hesperidin and nobiletin were detected at 283 nm.ResultsAmygdalin,honokiol,magnolol,hesperidin and nobiletin had good linearity within 12.10～242.00 μg/mL(r=0.999 8),7.65～153.00 μg/mL(r=0.999 3),6.37～127.40 μg/mL(r=0.999 7),4.29～85.80 μg/mL(r=0.999 9),3.90～78.00 μg/mL(r=0.999 2)respectively.The average recovery rates and RSD were 98.62%(0.88%),96.94%(1.12%),99.17%(1.10%),96.85%(1.04%) and 97.84%(1.55%)respectively.ConclusionThe developed HPLC method is accurate and reliable.

Key words：HPLC;Dingchuanzhike syrups;Amygdalin;Honokiol;Magnolol;Hesperidin;Nobiletin

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201602024

收稿日期：2015-06-16