閆 嵩，任偉超，劉振鵬，張開(kāi)雪，劉秀波，孫麗英，馬 偉

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040

黃芪多糖、皂苷、黃酮含量之間的相關(guān)性分析*

閆 嵩，任偉超，劉振鵬，張開(kāi)雪，劉秀波，孫麗英，馬 偉△

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040

目的：研究分析植物黃芪各部位有效成分間的相關(guān)性。方法：對(duì)膜莢黃芪植株根莖葉的折干率及主要藥效活性成分多糖、黃酮、皂苷的含量進(jìn)行了相關(guān)性和回歸分析。結(jié)果：黃芪的黃酮、皂苷、多糖含量和黃芪植物的折干率有低度相關(guān)性；黃芪多糖含量在根莖葉之間，黃芪皂苷含量在莖和葉之間，黃芪黃酮含量在莖和根之間，黃芪的皂苷和黃酮含量在莖中，黃芪黃酮、皂苷和多糖含量在根中都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著相關(guān)性和極顯著的線性回歸關(guān)系；在葉中，黃芪的黃酮、皂苷、多糖含量沒(méi)有顯著相關(guān)性。結(jié)論：黃芪初生代謝產(chǎn)物黃芪多糖和次生代謝產(chǎn)物黃芪黃酮、皂苷的累積具有相關(guān)性，各物質(zhì)的含量在根莖葉間的分布也有一定的相關(guān)性，這符合植物代謝物質(zhì)累積的規(guī)律。

黃芪;多糖含量;皂苷含量;黃酮含量;相關(guān)分析;回歸分析

黃芪是常用中藥材，是蒙古黃芪［Astragalus membranaceu(Fisch.)Bge.var.mongholicus Hsiao Bge.］或膜莢黃芪［Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.］的干燥根［1］。黃芪主要含有多糖、皂苷、黃酮等多種活性物質(zhì)，其活性物質(zhì)制劑黃芪多糖注射液［2］、黃芪甲苷注射液、黃芪注射液［3］等已被廣泛應(yīng)用于臨床。隨著黃芪藥效成分提取液的廣泛應(yīng)用，擴(kuò)大藥材來(lái)源就顯得尤為重要。黃芪的藥效成分不僅貯存在根中，其地上部分也有分布［4-5］。本研究對(duì)黃芪根莖葉內(nèi)黃芪多糖、皂苷、黃酮含量進(jìn)行了相關(guān)性和回歸分析，了解黃芪植株內(nèi)各部位藥用活性成分的分布規(guī)律，對(duì)黃芪藥效成分的生理代謝研究與將黃芪地上部分生物產(chǎn)量納入黃芪藥效成分提取原料研究具有一定的理論指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)所用膜莢黃芪種子(由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)提供)在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)日光溫室內(nèi)無(wú)土栽培培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)液采用Hoagland & Aunon全營(yíng)養(yǎng)液，光照強(qiáng)度2 000～2 500 Lux，日溫25～28℃，夜溫17～20℃，相對(duì)濕度60%～80%。黃芪苗期無(wú)土栽培裝置已申請(qǐng)實(shí)用新型專(zhuān)利，專(zhuān)利號(hào)為ZL201220490816.3。用于實(shí)驗(yàn)的黃芪從苗齡35天，苗高15 cm，七片真葉開(kāi)始，分別于0、3、6、9、12天采樣檢測(cè)。采樣后，105℃烘干0.5小時(shí)殺青，80℃烘至恒重，利用球磨機(jī)1 600 rpm粉碎20分鐘，用于待測(cè)成分的提取。黃芪多糖、皂苷、黃酮的含量測(cè)定采用722型數(shù)顯可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2 方法 本實(shí)驗(yàn)對(duì)175個(gè)黃芪植株的根、莖、葉的折干率，多糖、皂苷、黃酮含量進(jìn)行測(cè)量計(jì)算，具體方法如下：

1.2.1 多糖含量測(cè)定［6］

1.2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取對(duì)照品葡萄糖1 mg，置于10 mL容量瓶中，加水溶解，并定容到刻度，搖勻即得。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 用移液器精密量取對(duì)照品溶液0、0.015、0.03、0.045、0.060、0.075 mL，分別置1.5 mL離心管中，然后加水至0.075 mL，再分別加入2%蒽酮乙酸乙酯溶液0.075 mL，置冰浴中緩緩加入硫酸溶液0.75 mL，搖勻后置沸水浴中保溫1分鐘，取出后立即冰浴冷卻至室溫，在630 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=26.976X+ 0.0312，R2=0.999 6。

1.2.1.3 樣品多糖含量的測(cè)定 用移液器精密量取樣品0.075 mL，按照測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法操作，顯色穩(wěn)定后，12 000 rpm離心5分鐘后上機(jī)測(cè)定吸光度值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的黃芪多糖含量。

1.2.2 皂苷含量測(cè)定［7］

1.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取對(duì)照品黃芪甲苷5 mg，置10 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解，并稀釋定容至刻度，搖勻即得。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 用移液器精密量取對(duì)照品溶液0、0.015、0.03、0.045、0.060、0.075 mL，分別置1.5 mL離心管中，分別準(zhǔn)確加入無(wú)水乙醇至0.075，再分別加入8%香草醛無(wú)水乙醇試劑0.075 mL，混勻，置冰浴中緩緩加入72%硫酸溶液0.75 mL，搖勻后置62℃水浴中保溫20分鐘，取出后立即冰浴冷卻至室溫，在544 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=20.59X-0.081 9，R2=0.998 9。

1.2.2.3 樣品黃酮含量的測(cè)定 用移液器精密量取樣品0.075 mL，按照測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法操作，顯色穩(wěn)定后，12 000 rpm離心5分鐘后上機(jī)測(cè)定吸光度值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的黃酮含量。

1.2.3 黃酮含量測(cè)定［8］

1.2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取對(duì)照品蘆丁0.998 mg，置10 mL容量瓶中，加30%乙醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 用移液器精密量取對(duì)照品溶液0、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別置1.5 mL離心管，分別加入5%亞硝酸鈉0.03 mL，混勻放置6分鐘，加入10%硝酸鋁溶液0.03 mL，混勻放置6分鐘，加入IN氫氧化鈉溶液0.4 mL，分別用30%的乙醇定容至1 mL，混勻放置15分鐘，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=1.222X+0.0075，R2=0.999 9。

1.2.3.3 樣品黃酮含量的測(cè)定 用移液器精密量取兩份待測(cè)樣品0.54 mL，分別置于1.5 mL離心管中，其中一管按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，依次加入顯色劑，另一管則加入和顯色劑等體積的水做空白對(duì)照，顯色后12 000rpm離心5min，上機(jī)比色測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品黃酮含量。

1.2.3.4 黃芪植株折干率測(cè)定 將實(shí)驗(yàn)處理的無(wú)土栽培黃芪植株的根系用吸水紙吸干水分，用天平進(jìn)行稱(chēng)量鮮質(zhì)量，然后殺青烘至恒干后稱(chēng)量干質(zhì)量。利用如下公式計(jì)算折干率。

折干率=(植株干重/植株鮮重)×100%

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性和回歸性分析。

2 結(jié)果

2.1 相關(guān)性分析結(jié)果 當(dāng)|r|值介于0.4～0.7之間時(shí)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著性線性關(guān)系的黃芪生物活性物質(zhì)是：葉多糖含量和根多糖含量、莖多糖含量，相關(guān)系數(shù)是0.561、0.614；葉皂苷含量和莖黃酮含量、莖皂苷含量，相關(guān)系數(shù)是-0.442、-0.421；根多糖和根皂苷含量、根黃酮含量、莖多糖含量、莖黃酮含量，相關(guān)系數(shù)是0.414、0.407、0.595、0.442；根皂苷和根黃酮含量、莖黃酮含量，相關(guān)系數(shù)是0.691、0.503；根黃酮含量和莖黃酮含量，相關(guān)系數(shù)是0.630；莖黃酮含量和莖皂苷含量，相關(guān)系數(shù)是0.587。其他的關(guān)系|r|值都小于0.4，屬于低度的線性關(guān)系。這些關(guān)系中沒(méi)有|r|值大于0.7的情況，即它們各個(gè)關(guān)系之間不存在高度線性相關(guān)性。其中r值為正數(shù)，說(shuō)明它們之間具有正的線性相關(guān)性；r值為負(fù)數(shù)，說(shuō)明它們具有負(fù)的線性相關(guān)性。見(jiàn)表1。

2.2 回歸分析結(jié)果 根和莖的多糖含量與葉多糖含量之間、根多糖含量和莖多糖含量之間、根黃酮含量和莖黃酮含量之間、莖皂苷含量和葉皂苷含量之間、根皂苷含量和根黃酮含量與根多糖之間、根黃酮含量與根皂苷含量之間、莖黃酮含量與莖皂苷含量之間有極顯著的直線回歸關(guān)系。見(jiàn)表2。

表1 多糖含量、皂苷含量、黃酮含量、折干率的相關(guān)性

表2 回歸分析結(jié)果

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芪的黃酮、皂苷、多糖含量和黃芪植物的折干率只存在低度相關(guān)性；黃芪多糖含量在根、莖、葉間的分布具有顯著相關(guān)性，黃芪莖、根多糖含量和黃芪葉多糖含量以及黃芪根多糖含量和莖多糖含量具有極顯著的線性回歸關(guān)系；黃芪皂苷含量在根、莖、葉間具有一定的相關(guān)性，莖和葉間的含量達(dá)到了顯著相關(guān)性，具有極顯著的線性回歸關(guān)系；黃酮含量在根、莖、葉間的分布具有一定的相關(guān)性，只有在莖和根之間的含量達(dá)到了顯著的相關(guān)性，具有極顯著的線性回歸關(guān)系；在葉中，黃芪的黃酮、皂苷、多糖含量沒(méi)有顯著的相關(guān)性；在莖中，黃芪的皂苷和黃酮含量具有顯著的相關(guān)性和極顯著的線性回歸關(guān)系；在根中黃芪黃酮、皂苷和多糖含量具有顯著的線性相關(guān)性和極顯著的線性回歸關(guān)系。

多糖來(lái)源于植物初生代謝，黃酮和皂苷來(lái)源于植物次生代謝［9］。本研究結(jié)果說(shuō)明了黃芪初生代謝產(chǎn)物黃芪多糖和次生代謝產(chǎn)物黃芪黃酮、皂苷的累積具有相關(guān)性，各物質(zhì)的含量在根莖葉間的分布也有一定的相關(guān)性，這符合植物代謝物質(zhì)累積的規(guī)律［10］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃芪多糖、皂苷、黃酮含量在根、莖、葉各部位之間的分布及種類(lèi)之間含量關(guān)系的相互影響進(jìn)行了立體研究，為進(jìn)一步研究黃芪多糖、皂苷、黃酮代謝途徑及合成部位提供了一定的理論方向。

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［2］ 時(shí)瀟麗，姚春霞，林曉，等.多糖藥物應(yīng)用與研究進(jìn)展［J］.中國(guó)新藥雜志，2014，23(9)：1057-1062.

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Correlation Analysis of Levels of Astraglus Polysaccharides, Saponin and Flavone

YAN Song,REN Weichao,LIU Zhenpeng,ZHANG Kaixue,LIU Xiubo,SUN Liying,MA Wei△
Pharmaceutical College of Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China

Objective: To analyze the correlation of effective components in various part of HuangQi(astraglus). Methods: Drying rate of plant root, rhizome and leaf of astraglus membranceus and the level of main active components(Polysaccharides, Saponin and Flavone) were given correlation and regression analysis. Results: The levels of flavone, saponin and polysaccharides in HuangQi and drying rate of HuangQi plant had low correlation; the levels of astraglus polysaccharides existed between root, rhizome and leaf, the level of astraglus saponin between rhizome and leaf, the level of astraglus flavone between rhizome and root, the level of astraglus saponin and flavone in rhizome, the level of astraglus flavone, saponin and polysaccharides in root, there were statistical significant correlation and highly significant linear regression relation; in leaf, the level of astraglus flavone, saponin and polysaccharides had no significant correlation. Conclusion: Astraglus primary metabolites(astraglus polysaccharides) and the accumulation of secondary metabolites(astraglus flavone and saponin) have relations, the level of various part distributed in root, rhizome and leaf also have a certain correlation, this meets the law of plant metabolism and substance accumulation.

HuangQi; polysaccharides level; saponin level; flavone level; correlation analysis; regression analysis

R284.1

A

1004-6852(2016)12-0029-03

2016-06-29

國(guó)家自然基金(編號(hào)81274010)；黑龍江省杰出青年基金(編號(hào)JC201101)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)“優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計(jì)劃”(編號(hào)2012001)；哈爾濱市優(yōu)秀學(xué)科帶頭人基金(編號(hào)2014RFXXJ122)；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(編號(hào)12541743)。

閆嵩(1989—)，男，在讀碩士研究生。研究方向： 藥用植物生物工程。

△通訊作者：馬偉(1969—)，女，博士學(xué)位，研究員，博士研究生導(dǎo)師。研究方向：藥用植物生物工程。