潘曌曌，王雪峰

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽110032

連翹體外、體內(nèi)抗甲型流感病毒的實驗研究*

潘曌曌，王雪峰

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽110032

目的：觀察連翹體外、體內(nèi)抗甲型流感病毒的作用。方法：采用血凝實驗方法，將不同濃度流感病毒接種雞胚尿囊腔制造甲型流感病毒感染雞胚模型，觀察不同濃度連翹提取物對造模后雞胚的預(yù)防和治療作用。采用鼻腔接種甲型流感病毒FM1株誘導(dǎo)幼齡昆明種小鼠肺炎，將不同濃度連翹提取物以灌胃給藥途徑治療小鼠流感病毒性肺炎，觀察各組小鼠一般狀態(tài)、肺指數(shù)、肺組織形態(tài)學(xué)及對IV RNA表達(dá)的影響。結(jié)果：中藥連翹可預(yù)防流感病毒在雞胚內(nèi)增殖，其預(yù)防作用隨藥物濃度降低而減弱，但各濃度之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。中藥連翹對感染IV雞胚具有治療作用，其治療作用隨濃度降低而減弱，但各濃度間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。中藥連翹可改善流感病毒肺炎小鼠一般狀態(tài)，可減輕流感病毒肺炎小鼠肺組織病變，并抑制流感病毒在小鼠肺組織中復(fù)制。結(jié)論：中藥連翹提取物具有體外抗流感病毒作用及對流感病毒肺炎小鼠的治療作用。

連翹；甲型流感病毒；雞胚；流感病毒性肺炎

病毒性肺炎是嚴(yán)重危害兒童健康的常見疾病，其中流感病毒是主要病源之一。流感傳播迅速，短時間內(nèi)可造成局部地區(qū)的爆發(fā)或全球范圍的流行，導(dǎo)致災(zāi)難性的后果。目前對抗流感病毒尚無特效藥，少數(shù)有一定療效的藥物又多有毒副作用。中醫(yī)古籍中沒有流感病毒及流感病名的記載，根據(jù)其流行規(guī)律和致病特點，流感病毒相當(dāng)于“溫毒”“溫?zé)釙r毒”，流感屬于“溫病”“時行病”“疫癘”等范疇。銀翹散源于清代醫(yī)家吳鞠通所著《溫病條辨》，具有辛涼解表、清熱解毒的功效。方中主要藥物連翹味苦、微寒，可清熱解毒，消腫散結(jié)，主要用于風(fēng)熱感冒、溫病初起、溫?zé)崛霠I、高熱煩渴、神昏發(fā)斑等癥的治療［1］。筆者對連翹體外、體內(nèi)抗流感病毒作用進(jìn)行系列研究，旨在闡明該藥在中藥復(fù)方銀翹散中抗流感病毒作用的藥理作用，為探求有效的中醫(yī)藥抗流感病毒方藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒 甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株A/FM1/47(H1N1)，由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所提供，凍存于遼寧中醫(yī)病毒室，經(jīng)鼠肺、雞胚傳代后為FM1M9E2M1E3M2E4M1E5。

1.2 雞胚 9日齡尼克白種雞胚，SPF級，購買于遼寧省益康生物制品廠。

1.3 動物 昆明種小鼠，雄性12～14 g，購自中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部，動物實驗許可證號：SCXK (遼)2003-0009。

1.4 實驗藥品制備 連翹飲片(購自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥局)，加入80%乙醇14倍量，加熱回流2小時，藥渣再加80%乙醇10倍量，加熱回流1小時，合并2次提取濾液，濃縮后烘干，研粉避光冷藏備用。用于體外實驗時，以生理鹽水配成濃度為400 mg(生藥)/mL溶液，高速離心機(jī)4 000 r/min離心30分鐘，取上清高溫高壓滅菌后4℃冷藏備用。病毒唑注射液(江蘇吳中實業(yè)股份有限公司，批號：060208)。1%雞紅細(xì)胞懸液(采集健康公雞血，阿氏液抗凝，離心洗滌棄上清，無菌生理鹽水配制成1%懸液，4℃冷藏備用)［2］。

1.5 儀器 SG403TXCE型全外排Ⅱ級生物安全柜(美國Baker公司)；臺式壓力蒸汽滅菌器(沈陽盛達(dá)生物電子設(shè)備有限公司)；RM2135型精密輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國LEICA公司)；BX50F4型系統(tǒng)生物顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)；DU-600型蛋白-核酸分析儀(美國Beckman公司)；PE-9600型PCR儀(美國PERKIN ELMER公司)；BIOFUGE28RS型低溫高速離心機(jī)(德國HERAEUS公司)；EPS-300型電泳儀(上海天能公司)；天能凝膠分析系統(tǒng)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；AS3120電子超聲儀。

1.6 實驗方法

1.6.1 連翹提取物體外抗流感病毒實驗研究

1.6.1.1 流感病毒增毒及其在雞胚上半數(shù)感染量(EID50)的測定 將病毒原液接種于9日齡SPF雞胚尿囊腔，每胚接種0.1 mL，石蠟封口，33～35℃溫箱孵育48小時，4℃過夜。收取尿囊液，紅細(xì)胞凝集實驗測血凝滴度。將增毒后的流感病毒原液系列對數(shù)稀釋(10-1～10-12)，分別接種在事先標(biāo)記好的雞胚尿囊腔內(nèi)，每個濃度接種4個雞胚，并做生理鹽水對照。將注射流感病毒的雞胚放入33～35℃溫箱內(nèi)，48小時后取出放入4℃冰箱內(nèi)過夜；收取尿囊液，每胚0.1 mL依次加入作好標(biāo)記的血凝板上，再加入預(yù)先配制好的1%的雞血球0.1 mL，輕搖后40分鐘觀察結(jié)果，用karber公式［2］計算。測得EID50為10-6.28，實驗用100EID50。

1.6.1.2 連翹提取物及利巴韋林注射液對雞胚最大無毒濃度(TD0)的測定 用含PS10%的生理鹽水將藥物原液作連續(xù)2倍系列稀釋至1∶512濃度，每次抽取0.2 mL分別接種在預(yù)先作好標(biāo)記的雞胚上，每個濃度接種4個雞胚，并設(shè)生理鹽水對照。將接種好的雞胚放入33～35℃溫箱內(nèi)孵育48小時，每12小時觀察記錄雞胚存活情況，24小時內(nèi)死亡的雞胚不記入藥物毒性作用致死數(shù)。因連翹提取物組自原液起未發(fā)現(xiàn)死亡雞胚，故將原液濃度400 mg/mL作為藥物最大無毒濃度，利巴韋林注射液最大無毒濃度：50 mg/mL。

1.6.1.3 連翹提取物對甲型流感病毒感染雞胚的預(yù)防和保護(hù)作用研究 1)預(yù)防作用。藥物原液自TD0開始2倍比稀釋3個濃度(400、200、100 mg/mL)，每胚0.1 mL分別接種雞胚，每個濃度8個雞胚，37℃孵育2小時，并設(shè)生理鹽水和病毒對照；然后分別接種0.1 mL的100EID50的病毒懸液，放入33～35℃溫箱內(nèi)48小時，4℃過夜。抽取尿囊液，測定血凝滴度。2)治療作用。用100EID50病毒懸液接種雞胚，33～35℃孵育2小時，再分別接種與預(yù)防實驗同濃度的藥液，每組8個雞胚，并設(shè)生理鹽水及病毒對照。33～35℃溫箱內(nèi)48小時，再以4℃過夜。抽取尿囊液，測定血凝滴度。

1.6.2 連翹提取物對流感病毒肺炎小鼠的治療作用

1.6.2.1 甲型流感病毒FM1株對小鼠半數(shù)致死量(LD50)的測定［2］將增毒后的新鮮尿囊液10倍系列稀釋6個濃度(10-1～10-6)；將30只昆明種小鼠隨機(jī)分成6組，每組5只；在乙醚麻醉下經(jīng)鼻腔接種甲型流感病毒FM1株，每組接種同一個濃度(0.05 mL/只)；連續(xù)觀察14天，記錄小鼠死亡情況，并進(jìn)行死亡百分率統(tǒng)計，應(yīng)用Reed和Muench公式計算LD50為4.5。

1.6.2.2 動物分組 依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法，將40只昆明種小鼠分為4組，分別為連翹治療組(連翹組)10只、正常對照組(正常組)10只、病毒對照組(模型組)10只、病毒唑?qū)φ战M(病毒唑組)10只。1.6.2.3 模型復(fù)制 除正常組外，各組均造模。依照文獻(xiàn)［3-4］在乙醚麻醉下經(jīng)鼻腔接種15LD50甲型流感病毒FM1株，每只0.05 mL，正常組在同等條件下接種等量不含病毒的生理鹽水。

1.6.2.4 給藥與飼養(yǎng) 將連翹提取物用蒸餾水配制成水溶劑，濃度為0.06 g生藥/mL，于感染前1天，連翹組開始灌胃給藥，1次/d，0.5 mL/次；西藥對照組將病毒唑注射液以無菌生理鹽水配成濃度為10 mg/mL，每次腹腔注射0.1 mL，1次/d。各組給藥量相當(dāng)于60 kg成人臨床等效量。正常組和模型組均以等體積的生理鹽水灌胃。所有動物在同一條件下(全外排Ⅱ級生物安全柜，室溫20～24℃，相對濕度65%)，用普通飼料喂養(yǎng)，控制飲食，自由飲水。

1.6.2.5 標(biāo)本取材 各組小鼠在感染第5天稱重后斷頸處死，處死前禁食禁水4小時以上。無菌條件下摘取肺臟。將肺組織放入無菌生理鹽水中洗滌兩次，用無菌濾紙吸干表面水分，觀察病變程度，稱出肺的質(zhì)量，取左側(cè)肺葉放入無菌EP管中，迅速置于冰壺中，在-80℃冰箱中保存用于RT-PCR檢測；右側(cè)肺葉用4%多聚甲醛固定用于組織病理檢測。

1.6.2.6 模型鑒定及中藥提取物對小鼠流感病毒性肺炎治療作用 1)每天觀察各組小鼠皮毛色澤、飲食、活動情況和精神狀態(tài)，定期測量體質(zhì)量。2)光鏡下肺組織形態(tài)觀察：將固定好的組織包埋成蠟塊，切片機(jī)切片，常規(guī)脫蠟至水，蘇木素、伊紅染色，脫水封片，置顯微鏡下觀察。3)肺指數(shù)：肺指數(shù)=小鼠肺質(zhì)量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)×100%。4)RT-PCR法檢測肺組織懸液IV總RNA表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組的計量資料采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度連翹提取物對甲型流感病毒感染雞胚預(yù)防和治療作用 預(yù)防和治療血凝效價因數(shù)連翹提取物組、陽性對照組與病毒對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；高濃度連翹提取物組與陽性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。預(yù)防血凝效價因子中、低濃度連翹提取物組與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。治療血凝效價因子各濃度連翹提取物組與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 不同濃度連翹提取物對流感病毒感染雞胚的預(yù)防和治療作用

表1 不同濃度連翹提取物對流感病毒感染雞胚的預(yù)防和治療作用

注：與病毒對照組比，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與陽性對照組比，#表示P＜0.05，△表示P＞0.05。

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2.2 連翹提取物對流感病毒肺炎小鼠的治療作用

2.2.1 肺指數(shù)改變 肺指數(shù)模型組與正常組、連翹組、病毒唑組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；病毒唑組與連翹組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 各組小鼠肺指數(shù)比較

表2 各組小鼠肺指數(shù)比較

注：與正常組比較，★★表示P＜0.01；與模型組比較，**表示P＜0.01；與病毒唑組比較，#表示P＜0.05，△表示P＞0.05。

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2.2.2 各組小鼠行為觀察 正常組小鼠精神良好，毛發(fā)有光澤，活動敏捷，呼吸正常，飲食正常，體質(zhì)量自然增長。模型組小鼠呼吸較急促，毛發(fā)無光澤，行動遲緩，抱團(tuán)蜷縮，畏寒怕冷，飲食減少，明顯消瘦。各濃度連翹組和病毒唑組，在感染后第2天出現(xiàn)輕微畏寒無力，呼吸較急促，毛發(fā)欠光澤，飲食減少，體質(zhì)量下降，給藥后第4天狀態(tài)開始好轉(zhuǎn)，活動和飲食增加，第5天癥狀明顯減輕。

2.2.3 肺組織光鏡病理組織學(xué)觀察 正常組小鼠肺泡、肺泡囊、肺泡隔形態(tài)完整，周圍血管未見炎細(xì)胞浸潤；模型組小鼠肺泡、肺泡囊、肺泡管、肺泡隔等正常組織結(jié)構(gòu)消失，肺泡間隔增厚、水腫，內(nèi)含有大量炎細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張，間見大量紅細(xì)胞；連翹組病變明顯減輕，肺泡及肺泡隔形態(tài)完整，但仍有肺泡間隔增厚，少量炎細(xì)胞浸潤，結(jié)締組織間可見少量紅細(xì)胞，肺組織接近正常組；病毒唑組病變較其他各組輕，形態(tài)結(jié)構(gòu)在各治療組中最為完整，肺泡間隔增厚不明顯，偶見炎細(xì)胞浸潤，結(jié)締組織間可見少量紅細(xì)胞。見圖1。

圖1 肺組織光鏡病理圖片(HE，×200)

2.3 RT-PCR法檢測各組小鼠肺組織IV-RNA表達(dá) 正常組肺組織中未檢測到IV病毒核酸，病毒模型組在感染后第5天檢測到大量IV RNA表達(dá)。病毒核酸含量連翹組、病毒唑組均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；病毒唑組與連翹組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表3、圖2。

表3 各組藥物對肺組織中IV RNA表達(dá)的影響

表3 各組藥物對肺組織中IV RNA表達(dá)的影響

注：★★表示與正常組比較，P＜0.01；**表示與模型組比較，P＜0.01；##表示與陽性對照組比較，P＜0.01。

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圖2 各組小鼠肺組織中IV RNA擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳

3 討論

清代醫(yī)家吳鞠通所著《溫病條辨》中銀翹散是中醫(yī)臨床廣泛應(yīng)用的抗流感病毒療效確切的中藥復(fù)方之一，其中君藥連翹辛涼透邪，清熱解毒，在方中的作用和地位歷來被醫(yī)家所重視［3-6］。石鉞等［7］對銀翹散抗流感病毒活性進(jìn)行研究，篩選出了銀翹散抗流感病毒的有效部位群，并通過對各單味藥相應(yīng)部位總黃酮的測定，探討了各單味藥對有效部位的貢獻(xiàn)。結(jié)果表明，9味藥中連翹、金銀花、薄荷和荊芥對其貢獻(xiàn)最大，進(jìn)一步證實了連翹在銀翹散中舉足輕重的地位。

銀翹散君藥連翹提取物抗甲型流感病毒體內(nèi)、體外實驗是銀翹散抗流感病毒系列研究的一部分，銀翹散全方抗流感病毒作用在我們前期實驗中已得到證實［8-9］。本實驗結(jié)果表明，連翹提取物具有很強(qiáng)的直接殺滅流感病毒的作用，并且對流感病毒肺炎小鼠治療作用效果顯著。

中藥抗病毒具有療效顯著、副作用少、作用靶點多等優(yōu)勢，加強(qiáng)對臨床上療效顯著的傳統(tǒng)復(fù)方中單味藥的研究，并應(yīng)用現(xiàn)代藥理學(xué)方法弄清單味藥中所含的化合物的種類、結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及含量，是中醫(yī)藥現(xiàn)代化的發(fā)展方向。

［1］ 范為宇，張早華，蘇大明，等.防治流感方藥篩選的臨床研究文獻(xiàn)分析［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2006，13(8)：99-100.

［2］ 郭元吉.流行性感冒病毒及實驗技術(shù)［M］.北京：中國三峽出版社，1997：221.

［3］ 肖會敏，王四旺，王劍波，等.連翹抗病毒的研究進(jìn)展［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2010(2)：9-10.

［4］ 鄒曉華，何偉康，戴安印，等.高效液相色譜法測定感冒熱毒清合劑中連翹苷的含量［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2015，12(15)：117-119.

［5］ 蔡清宇，唐慧慧.高效液相色譜法測定連花清瘟顆粒中連翹酯苷A含量［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2016，23(2)：98-100.

［6］ 李雙，王東強(qiáng)，李志軍.連翹藥理作用小議［J］.西部中醫(yī)藥，2012，25(1)：52-54.

［7］ 石鉞，石任兵，劉斌，等.銀翹散抗流感病毒有效部位群總黃酮含量的測定［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2001，24(2)：44-45.

［8］ 張振巍，張娜娜.清喉咽合劑中連翹苷不同定量方法對比分析［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2013，20(3)：65-66.

［9］ 穆廷杰，楊芬蘭，金海紅，等.連翹等中草藥對肺炎克雷伯菌抑菌作用的實驗研究及臨床應(yīng)用［J］.西部中醫(yī)藥，2015，28(9)：19-21.

Experimental Study on LianQiao in Resisting Influenza A Virus in Vivo and Vitro

PAN Zhaozhao,WANG Xuefeng
Affiliated Hospital of Liaoning University of Chinese Medicine,Shenyang 110032,China

Objective: To observe the effects of LianQiao(fructus forsythiae) in resisting influenza A virus in vivo and vitro. Methods: The preventive effects and therapeutic effects of LianQiao with different concentrations on chicken embryro were observed after preparing chicken embryro with influenza A virus by injecting different concentrations of influenza A virus. mice pneumonia of inborn from kunming were induced by adopting inocualtion influenza A virus FM1 though nasal cavity, general state, lung index, lung histogical morphology, the influences on IV and RNA expressions were observed. Results: LianQiao can prevent proliferation of influenza virus in chicken embryro, the prevention effects decreased with concentration decreased, but there were no statistical differences between different concertrations(P＞0.05). LianQiao had treatment function for chicken embryo infected with IV, the treatment function decreased with concertration decreased, but there were no statistical differences between different concertrations(P＞0.05). LianQiao can improve the general state of pneumonia mice with influenza, relieve lung tissue lesion, inhibit replication of influenza in mice lung tissue. Conclusion: LianQiao extraction has the effects of resisting influenza in vitro and treatment function for pneumonia mice with influenza virus.

LianQiao; influenza A virus; chicken embryro; influenza viral pneumonia

R373.1

A

1004-6852(2016)12-0005-04

2016-04-08

國家教育部博士點基金課題(編號20040162004)；國家自然科學(xué)基金資助項目(編號30772880)。

潘曌曌(1976—)，女，博士學(xué)位，副主任醫(yī)師。研究方向：中藥抗病毒的臨床及實驗研究。