劉源源，劉軍，鄒宇曉，廖森泰，秦小明（.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江54088；.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州5060）

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抗疲勞功能食品檢測(cè)評(píng)價(jià)研究進(jìn)展及新思路

劉源源1，2，劉軍2，鄒宇曉2，廖森泰2，秦小明1
（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510610）

摘要：疲勞是指機(jī)體不能持續(xù)特定水平的機(jī)能或器官不能維持預(yù)定運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的生理狀態(tài)。概述現(xiàn)有抗疲勞活性研究的檢測(cè)評(píng)價(jià)手段，闡述疲勞與抗疲勞的產(chǎn)生機(jī)制，并希望從細(xì)胞能量代謝的角度來建立疲勞細(xì)胞模型，確立快速篩選抗疲勞組分的方法，為抗疲勞功能食品研發(fā)提供新思路。

關(guān)鍵詞：抗疲勞；檢測(cè)；評(píng)價(jià)；細(xì)胞代謝模型；新思路

步入21世紀(jì)，快節(jié)奏的生活使高壓狀態(tài)的人群倍感疲勞，易出現(xiàn)體力不支、工作效率降低的情況，疲勞也成為保健食品和運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所關(guān)注的話題。目前我們對(duì)疲勞的理解已經(jīng)從單純的軀體疲勞擴(kuò)展到精神和認(rèn)知的功能失調(diào)。疲勞作為一種非特異的癥狀不僅存在于許多疾病中，而且作為一個(gè)獨(dú)立癥狀存在于普通人群中。在疲勞的狀態(tài)下，人們的免疫力削弱更易罹患各種感染性疾病，因此，緩解疲勞實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量的生活是亟待解決的難題。

現(xiàn)有的抗疲勞功能保健食品的檢驗(yàn)和評(píng)價(jià)通過體內(nèi)體外相結(jié)合的方式來評(píng)價(jià)，但依靠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過體內(nèi)消化代謝，真正功效因子卻無法定性，而體外實(shí)驗(yàn)主要依據(jù)抗氧化作為判斷抗疲勞效果的依據(jù)。這些措施不能確定抗疲勞活性成分的結(jié)構(gòu)和物質(zhì)基礎(chǔ)，不能實(shí)現(xiàn)活性成分和抗疲勞構(gòu)效關(guān)系的對(duì)應(yīng)，對(duì)抗疲勞的作用機(jī)理也是模糊的。隨著細(xì)胞分子生物學(xué)和生物化學(xué)的研究深入，運(yùn)用疲勞細(xì)胞模型快速高效地對(duì)抗疲勞保健食品進(jìn)行檢驗(yàn)和評(píng)價(jià)，有望為抗疲勞功能食品標(biāo)準(zhǔn)化檢驗(yàn)評(píng)價(jià)體系提供參考和思路。

1疲勞與抗疲勞

1982年第五屆國際運(yùn)動(dòng)生化會(huì)議統(tǒng)一了疲勞的概念：機(jī)體生理過程不能持續(xù)其機(jī)能在一特定水平或各器官不能維持預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度[1]。針對(duì)疲勞產(chǎn)生的機(jī)制不同，衍生出5個(gè)機(jī)理性學(xué)說，包括能源物質(zhì)耗竭學(xué)說、代謝產(chǎn)物堆積學(xué)說、內(nèi)環(huán)境平衡失調(diào)學(xué)說、自由基影響理論和保護(hù)性抑制學(xué)說[2]，但至今由于疲勞產(chǎn)生的復(fù)雜性尚無定論。機(jī)體超負(fù)荷工作和運(yùn)動(dòng)時(shí)，人體會(huì)出現(xiàn)機(jī)能下降和體力不支的癥狀，并伴有生理指標(biāo)的變化，而骨骼肌細(xì)胞則會(huì)出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)改變，內(nèi)環(huán)境代謝紊亂，影響著骨骼肌正常代謝和生物氧化過程。

抗疲勞是延緩疲勞產(chǎn)生和（或）加速疲勞消除的總稱[3]?，F(xiàn)有的體外實(shí)驗(yàn)多根據(jù)體外抗氧化清除自由基來實(shí)現(xiàn)抗疲勞，疲勞是一個(gè)復(fù)雜的生理狀態(tài)，因此這種解釋也存在一定片面性?？傊蛊诘难芯恳褟某Ｒ?guī)生化指標(biāo)逐步深入分子生物學(xué)層面，依據(jù)現(xiàn)有生物化學(xué)建立疲勞細(xì)胞模型不僅可根據(jù)相應(yīng)指標(biāo)變化實(shí)現(xiàn)對(duì)抗疲勞功能食品效果的評(píng)價(jià)，而且對(duì)抗疲勞的作用機(jī)理也有深入了解。

2現(xiàn)有抗疲勞檢驗(yàn)評(píng)價(jià)手段

抗疲勞活性的檢驗(yàn)評(píng)價(jià)一般借助動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完成，通過運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)建立動(dòng)物疲勞模型，進(jìn)而開展相應(yīng)生理生化指標(biāo)測(cè)定?！侗＝∈称窓z驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003版）[4]中明確規(guī)定：負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性，且血乳酸、血清尿素、肝糖原/肌糖原3項(xiàng)生化指標(biāo)中任兩項(xiàng)指標(biāo)陽性，可判定該受試樣品具有緩解體力疲勞功能的作用。經(jīng)過長期大量的運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)在對(duì)疲勞的機(jī)制機(jī)理和生化指標(biāo)已經(jīng)有更全面的認(rèn)識(shí)，更多的耐力運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)方式和生化指標(biāo)也可以納入抗疲勞的參考和評(píng)判。

2.1耐力運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)

抗疲勞評(píng)估多以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為主，運(yùn)動(dòng)性疲勞動(dòng)物模型已經(jīng)成為運(yùn)動(dòng)性疲勞深入研究的重要途徑，所以標(biāo)準(zhǔn)化、理想的運(yùn)動(dòng)性疲勞模型無疑是實(shí)施有損傷情況下疲勞研究的首要環(huán)節(jié)[5]。運(yùn)動(dòng)耐力的提高是抗疲勞能力加強(qiáng)最直接的表現(xiàn)，而缺氧對(duì)機(jī)體是一種劣性刺激[4]，影響機(jī)體的氧化供能導(dǎo)致疲勞，耐缺氧能力反應(yīng)了機(jī)體抗疲勞的能力[6]，很多實(shí)驗(yàn)針對(duì)運(yùn)動(dòng)耐力和耐缺氧作為動(dòng)物抗疲勞實(shí)驗(yàn)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)展開?，F(xiàn)有的運(yùn)動(dòng)耐力試驗(yàn)可以測(cè)量體重，采用運(yùn)動(dòng)耐力實(shí)驗(yàn)有跑臺(tái)試驗(yàn)[7]和小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)[8]，爬桿試驗(yàn)[9]、Morris水迷宮試驗(yàn)、鼠尾懸掛試驗(yàn)[10]和旋轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)[11]也被廣泛采用，此外還有肌肉刺激實(shí)驗(yàn)[12-13]等等。

2.2生化指標(biāo)

抗疲勞試驗(yàn)需要結(jié)合動(dòng)物耐力試驗(yàn)，對(duì)生化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)評(píng)估。雖然實(shí)驗(yàn)表明運(yùn)動(dòng)疲勞會(huì)導(dǎo)致多種組織器官發(fā)生變化，但運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的大小并不都是與機(jī)體的生化改變相一致，因此并非所有因運(yùn)動(dòng)而變化的生化指標(biāo)都適合用來作為疲勞或抗疲勞作用的評(píng)判指標(biāo)。表1列出已有報(bào)道的比較認(rèn)同的生化指標(biāo)。

表1抗疲勞評(píng)價(jià)生化指標(biāo)及來源Table 1 Biochemical indicators and sources of anti fatigue evaluation

續(xù)表1抗疲勞評(píng)價(jià)生化指標(biāo)及來源Continue table 1 Biochemical indicators and sources of anti fatigue evaluation

可以看出，前人圍繞抗疲勞的產(chǎn)生機(jī)理學(xué)說做了大量探索性實(shí)驗(yàn)，篩選出的生化評(píng)價(jià)指標(biāo)涉及動(dòng)物多個(gè)組織部位。能量物質(zhì)耗竭學(xué)說闡述了疲勞的產(chǎn)生源于血糖糖原等能量物質(zhì)的減少，抗疲勞作用將有利于肌肉組織能源恢復(fù)，通過檢測(cè)血糖糖原等指標(biāo)變化，揭示其是否具有抗疲勞功效；內(nèi)環(huán)境平衡失調(diào)因體內(nèi)pH變化，激素異常，細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)酶類水平發(fā)生變化，而出現(xiàn)代謝紊亂，睪酮皮質(zhì)醇等激素含量上升，Na+-K+-ATP等轉(zhuǎn)運(yùn)酶轉(zhuǎn)運(yùn)速度也隨表達(dá)增強(qiáng)而加快；人體運(yùn)動(dòng)時(shí)呼吸作用增強(qiáng)，會(huì)堆積大量代謝產(chǎn)物，血液組織中乳酸尿素氮等含量會(huì)大幅上升，組織蛋白會(huì)有所下降；體內(nèi)自由基會(huì)影響細(xì)胞正常代謝，自由基理論包括自由基物質(zhì)、抗氧化物質(zhì)和自由基應(yīng)激產(chǎn)物，清除自由基增強(qiáng)抗氧化能力對(duì)細(xì)胞正常代謝起重要作用，運(yùn)動(dòng)中自由基產(chǎn)生則會(huì)使活性氧增高，抗氧化物質(zhì)GSH和SOD/MDA值降低，自由基刺激IL-6升高。長時(shí)間的運(yùn)動(dòng)，神經(jīng)沖動(dòng)和興奮遞質(zhì)不斷刺激大腦皮層，為避免機(jī)體內(nèi)環(huán)境的惡化和能源物質(zhì)的耗竭而出現(xiàn)大腦的保護(hù)性抑制，NO對(duì)神經(jīng)有抑制作用，根據(jù)該指標(biāo)可反映大腦疲勞程度?？傊?，疲勞是十分復(fù)雜的生理病理現(xiàn)象，需要從多個(gè)層面多種途徑進(jìn)行解釋。

3抗疲勞檢測(cè)評(píng)價(jià)新思路

現(xiàn)有抗疲勞功能食品的研究多集中于抗氧化-抗疲勞結(jié)合、中藥補(bǔ)虛等途徑，抗氧化食物已被大眾廣泛接受，而中藥抗疲勞沒有明確的理論解釋和具體說法，而能量的缺乏也是導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)疲勞的關(guān)鍵因素。徐曉陽[25]等通過電刺激骨骼肌細(xì)胞C2C12對(duì)細(xì)胞糖代謝進(jìn)行研究，肌糖原消耗隨刺激時(shí)間延長而增加，為保證細(xì)胞糖代謝的需要，其膜對(duì)胞外糖轉(zhuǎn)運(yùn)的能力會(huì)隨收縮時(shí)間延長而增強(qiáng)，骨骼肌細(xì)胞內(nèi)糖原合成酶的量則隨肌糖原儲(chǔ)量下降而增加，從而說明了疲勞與細(xì)胞能量代謝的關(guān)系密不可分。

另外，現(xiàn)有抗疲勞保健食品的評(píng)價(jià)均是以粗提物灌胃動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)展開的，其實(shí)驗(yàn)周期長，耗資大，操作繁瑣，且不能明確活性成分的物質(zhì)基礎(chǔ)，而細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)具有操作簡便、周期短、成本低等優(yōu)點(diǎn)[26]。在研究很多疾病時(shí)，研究人員通過模擬人體內(nèi)環(huán)境的建立許多細(xì)胞模型，如單層細(xì)胞模型[27]等，我們可以運(yùn)用細(xì)胞代謝通路建立疲勞細(xì)胞模型，采用細(xì)胞與活性組分共孵育的方式，根據(jù)特征生化指標(biāo)的變化對(duì)抗疲勞功能性成分進(jìn)行篩選，這將有望成為一種新型的快速篩選抗疲勞保健食品功效因子的研究方式。

下面介紹幾種和人體疲勞相關(guān)的細(xì)胞代謝通路，希望通過監(jiān)測(cè)分析細(xì)胞疲勞后的相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)，為疲勞細(xì)胞模型的建立奠定基礎(chǔ)。

3.1 AMPK信號(hào)通路

AMPK（腺苷酸活化蛋白激酶）是人體細(xì)胞的能量傳感器，也是細(xì)胞和全身能量平衡的調(diào)節(jié)器，AMPK受到激活的CaMKK和AMP/ATP增加影響而發(fā)生磷酸化變構(gòu)激活[28]。在脂質(zhì)代謝中，AMPK磷酸化ACC1/2和線粒體?；D(zhuǎn)移酶，調(diào)節(jié)CoA促進(jìn)脂肪β化；AMPK激活MCD，降低丙二酰輔酶A的水平來抑制脂肪合成底物供應(yīng)，且減少CPT1抑制增加脂質(zhì)氧化。而對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)，肝臟中AMPK誘導(dǎo)GLUT4（葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4）向胞膜移動(dòng)，還可以通過磷酸化轉(zhuǎn)錄來調(diào)控GLUT4的表達(dá)，增加的磷酸化AMPK活化GSK-3β，從而降低在肌酐（CRE）轉(zhuǎn)錄活性和PEPCK-C基因的表達(dá)，減少糖異生[29]。

當(dāng)運(yùn)動(dòng)疲勞導(dǎo)致體能下降時(shí)，AMPK則促進(jìn)骨骼肌葡萄糖的攝取和氧化、抑制肌糖原合成和分解，因此其在運(yùn)動(dòng)疲勞的能量供應(yīng)研究中具有重要意義。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體是膜蛋白主要轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)者[30]，骨骼肌細(xì)胞中的GLUT4對(duì)運(yùn)動(dòng)能量供應(yīng)起關(guān)鍵作用[31]，有利于能源物質(zhì)的恢復(fù)。骨骼肌中由NOS催化的NO則可增加局部激活cGMP（可溶性鳥苷酸環(huán)化酶），從而促進(jìn)GLUT4對(duì)葡萄糖攝取[32]。GSK-3β是直接調(diào)節(jié)的糖原合成酶的關(guān)鍵酶，是運(yùn)動(dòng)能量供應(yīng)障礙的關(guān)鍵調(diào)控因子，細(xì)胞能源物質(zhì)的提高對(duì)緩解疲勞其關(guān)鍵作用。因此運(yùn)動(dòng)后機(jī)體能源供應(yīng)的調(diào)控因子GLUT4、NOS和GSK-3β 3個(gè)指標(biāo)對(duì)疲勞的研究具有重要的指導(dǎo)意義，監(jiān)控和分析其變化趨勢(shì)可從AMPK通路上進(jìn)一步解釋疲勞與抗疲勞機(jī)制，為抗疲勞活性組分的篩選提供新思路。

3.2 PI3K/PKB/mTOR信號(hào)通路

PI3K/PKB/mTOR（磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素革巴蛋白）信號(hào)通路具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成的作用，骨骼肌mTOR是PI3K/PKB信號(hào)途徑和AMPK途徑及氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)共同的傳導(dǎo)信號(hào)，在表達(dá)水平上也不是線性關(guān)系，該信號(hào)通路受到生長因子與胰島素、營養(yǎng)因子、低能和缺氧等條件調(diào)控，其中低氧和運(yùn)動(dòng)均能促進(jìn)PI3K和PKB的表達(dá)，mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要通過對(duì)下游信號(hào)蛋白p70s6k產(chǎn)生效應(yīng)的，低氧抑制mTOR的表達(dá)而運(yùn)動(dòng)促進(jìn)其表達(dá)[33-35]。

低能缺氧是耐力運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)的測(cè)控條件，也是抗疲勞實(shí)驗(yàn)評(píng)估的重要手段。運(yùn)動(dòng)疲勞時(shí)mTOR對(duì)蛋白修復(fù)出現(xiàn)異常，提高其表達(dá)對(duì)蛋白質(zhì)合成的過程的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和營養(yǎng)平衡起關(guān)鍵作用[36]。同時(shí)介導(dǎo)Akt/mTOR途徑的IGF-1（促生長因子）是骨骼肌Akt和mTOR信號(hào)之間正反饋介質(zhì)[37]，IGF-1含量也可作為疲勞與抗疲勞作用的表征因子。因此該通路是對(duì)耐缺氧運(yùn)動(dòng)疲勞理論最好的闡釋，而骨骼肌響應(yīng)信號(hào)mTOR和IGF-1的表達(dá)則反應(yīng)了疲勞的程度和抗疲勞作用的效果。

3.3 PGC-1α通路

運(yùn)動(dòng)性過氧化物酶體增殖物受體γ共激活因子1α（PGC-1α）對(duì)維持糖異生蛋白，抗氧化酶的調(diào)節(jié)和線粒體生物合成起重要作用。通過PGC-1α過表達(dá)，線粒體中代謝因子和抗氧化酶含量增高，相關(guān)基因敲除則相反，表明骨骼肌中PGC-1α對(duì)能量利用和氧化能力提高有顯著作用[38]。當(dāng)肌肉收縮時(shí)，鈣離子使Ca2+/依賴蛋白激酶鈣調(diào)蛋白（CaMKIV）和磷酸酶等激活表達(dá)，增加cAMP響應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄目標(biāo)CaMKIV和肌肉增強(qiáng)因子2（MEF2）；同時(shí)PGC-1α表達(dá)可調(diào)節(jié)MAPK家族的關(guān)鍵酶絲裂原活化蛋白激酶p38 MAPK[39-40]，運(yùn)動(dòng)激活的p38MAPK可激活肌肉細(xì)胞GLUT4，提高葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)攝取和利用[41]，并調(diào)節(jié)骨骼肌呼吸酶的合成[39]。

運(yùn)動(dòng)能提高PGC-1α的表達(dá)，而運(yùn)動(dòng)疲勞時(shí)PGC-1α的表達(dá)會(huì)出現(xiàn)紊亂，提高其過表達(dá)來有效維持人體體能和代謝產(chǎn)物穩(wěn)態(tài)有重要作用。長時(shí)間運(yùn)動(dòng)會(huì)使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂，呼吸酶代謝異常，提高p38MAPK含量則會(huì)提升能源物質(zhì)攝取，對(duì)維持正常呼吸代謝有幫助。體內(nèi)糖原含量是運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和持久力的標(biāo)志，調(diào)節(jié)氧化能力可清除體內(nèi)代謝產(chǎn)物，均有助于抗疲勞作用。因此PGC-1α和p38MAPK的表達(dá)均可以作為評(píng)價(jià)抗疲勞的重要參數(shù)。

以上3大信號(hào)通路與疲勞和抗疲勞有著眾多聯(lián)系，同時(shí)也是相互聯(lián)系貫通的[42]。根據(jù)細(xì)胞模型建立的原則和規(guī)范[43]，對(duì)骨骼肌細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)處理，構(gòu)建骨骼肌疲勞細(xì)胞模型，通過細(xì)胞通路篩選出評(píng)價(jià)細(xì)胞疲勞的特征指標(biāo)，從而對(duì)抗疲勞物質(zhì)進(jìn)行快速篩選，這對(duì)抗疲勞功能食品的研發(fā)具有重要意義。

4　展望

隨著科學(xué)的發(fā)展，抗疲勞可運(yùn)用基因蛋白組學(xué)理論對(duì)機(jī)體、器官或細(xì)胞中蛋白進(jìn)行鑒定、定量、結(jié)構(gòu)分析及功能的研究，找出相應(yīng)的檢測(cè)評(píng)價(jià)方式和手段，這對(duì)明確抗疲勞保健食品的功效成分具有重要意義：首先，通過相應(yīng)醫(yī)學(xué)理論作支撐和指導(dǎo)，幫助我們清晰認(rèn)識(shí)疲勞的病理機(jī)制；其次，細(xì)胞模型可模擬人體內(nèi)環(huán)境，提供疲勞解決的新途徑、新思路；再者，以快速高效的檢驗(yàn)評(píng)價(jià)手段為平臺(tái)，將進(jìn)一步明確抗疲勞食品功能成分的構(gòu)效關(guān)系和量效關(guān)系，為開發(fā)保健食品和新藥提供新思路，也為建立更完善的抗疲勞功能食品標(biāo)準(zhǔn)化檢驗(yàn)評(píng)價(jià)體系提供理論參考。

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Research Progress and New Methods of Detection and Evaluation in Anti-fatigue Functional Food

LIU Yuan-yuan1，2，LIU Jun2，ZOU Yu-xiao2，LIAO Sen-tai2，QIN Xiao-ming1
（1. College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，Guangdong，China；2. Guangdong Key Laboratory of Agricultural Product Processing，Sericulture and Agro-food Processing Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510610，Guangdong，China）

Abstract：Fatigue refers to a physiological state which body cannot function for a certain level or organs cannot maintain a predetermined exercise intensity. The article overviews the existing evaluation means of detecting anti-fatigue activity and elaborates the generation mechanism of fatigue and anti-fatigue，and then proposes to establish fatigue cell model based on the view of energy metabolism，establishing rapid detection method of antifatigue ingredients，the aim of which provides new methods for the development of anti-fatigue functional food in the future.

Key words：anti-fatigue；detection；evaluation；cellular metabolic pathways；new methods

收稿日期：2014-09-30

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.052

作者簡介：劉源源（1988—），男（漢），碩士生，研究方向：食品科學(xué)。

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201403064）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)（CARS-22）；廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長基金項(xiàng)目（201433）