艾合麥提·吐爾遜，楊明輝，宋玉坤，徐志遠，姬鵬云，賈功雪，張金龍，張效生，朱士恩，劉國世*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，北京 100193； 2.新疆阿克蘇地區(qū)畜禽改良站 843001；

3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381)

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利用腹腔內(nèi)窺鏡方法比較不同輸精時間對羊體內(nèi)胚胎生產(chǎn)效率的影響

艾合麥提·吐爾遜1，2，楊明輝1，宋玉坤1，徐志遠1，姬鵬云1，賈功雪1，張金龍3，張效生3，朱士恩1，劉國世1*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，北京 100193； 2.新疆阿克蘇地區(qū)畜禽改良站 843001；

3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381)

摘要：為提高供體綿羊胚胎生產(chǎn)效率，實驗選取99只供體母羊，用FSH+CIDR法誘導發(fā)情超排。將正常發(fā)情的供體母羊隨機分成兩組進行輸精，分別在超排撤栓后的第48 h和54 h利用腹腔內(nèi)窺鏡法輸精。其中48 h輸精組供體母羊51只，54 h輸精組供體母羊48只。其結(jié)果顯示：撤栓后54 h輸精胚胎回收率極顯著高于48 h輸精組(P<0.01)；54 h輸精組供體卵母細胞受精率(97.27%)極顯著高于48 h輸精組(87.02%)(P<0.01)；54 h組供體平均可用胚數(shù)顯著高于48 h組(P<0.05)；撤栓后54 h利用腹腔內(nèi)窺鏡輸精組可用胚比率(89.70%)顯著高于48 h組(80.53%)(P<0.05)；移植后受體妊娠率，54 h組(70.44%)極顯著高于48 h組(56.92%)。本研究結(jié)果顯示，利用本實驗超排方案，供體撤栓后54 h利用內(nèi)窺鏡一次定時輸精相對于48 h輸精顯著提高了供體胚胎生產(chǎn)效率，對羊體內(nèi)胚胎生產(chǎn)提供理論和技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：羊；腹腔內(nèi)窺鏡；輸精時間；超數(shù)排卵；胚胎移植

資助項目：國家轉(zhuǎn)基因育種重大專項(2014ZX08008-002B、2014ZX08008-005)

E-mail:gshliu@cau.edu.cn

胚胎移植指的是“借普通家畜之腹懷優(yōu)秀個體之胎”，從而提高良種后代的生產(chǎn)效率，縮短雜交改良過程，而使種用性能差的雌性個體直接生產(chǎn)出良種后代，以迅速提高個體生產(chǎn)性能和整個畜群的畜產(chǎn)品品質(zhì)，從而帶來巨大的經(jīng)濟效益[1，2]。對于羊超數(shù)排卵供體的輸精目前主要有傳統(tǒng)開膣器輸精和內(nèi)窺鏡法輸精兩種。傳統(tǒng)的陰道開膣器子宮頸輸精技術(shù)操作簡單、成本低，但精液需要量大、受胎率低。而近年來逐漸推廣的內(nèi)窺鏡輸精技術(shù)輸精次數(shù)少、受胎率高[3]。1987年，我國首次應用腹腔鏡子宮深部輸精法，該技術(shù)通過腹腔鏡將種公羊精液直接輸送到排卵一側(cè)的子宮角受精部位。內(nèi)窺鏡輸精技術(shù)操作相對比較復雜，但其比常規(guī)子宮頸輸精技術(shù)受胎率有大幅的提高，能最大限度地發(fā)揮優(yōu)良公畜的利用率[4]。由于綿羊子宮頸特殊的解剖學關(guān)系，與牛的人工授精技術(shù)相比，綿羊人工授精的效率始終不高。 通過腹腔內(nèi)窺鏡輸精，子宮頸障礙可以被有效的規(guī)避[5]。人工輸精不同于自然配種，要人為地掌握好輸精的時間以使卵子得到更充分的成熟和保持精子最大的活率來完成受精過程。因此，輸精時間是制約內(nèi)窺鏡輸精效率的重要因素[6]。目前，國內(nèi)外關(guān)于不同輸精時間對內(nèi)窺鏡輸精供體體外胚胎生產(chǎn)效率影響的報道并不多見，本實驗針對內(nèi)窺鏡子宮深部輸精方法，探討48 h和54 h兩個不同輸精時間對供體胚胎生產(chǎn)效率的影響，以期優(yōu)化輸精方法，提高胚胎移植效率，并使之能夠在生產(chǎn)中得到廣泛的推廣和應用。

1材料與方法

1.1試驗用羊

于2014年11月～2015年5月選用遵化市雅華牧業(yè)有限公司的體重在60～80 kg，體況良好、無繁殖疾病經(jīng)產(chǎn)黑頭薩?？四秆蜃龉w；受體雜交小尾寒羊為1～4歲，體重在50 kg以上，膘情良好、無繁殖疾病。試驗前期補飼，確保體況中等以上；采精公羊為養(yǎng)殖場純種黑薩?？斯?，性欲良好，精液質(zhì)量檢測優(yōu)良。試情公羊為性欲旺盛的成年黑頭薩?？斯颉?/p>

1.2藥品與試劑

促黃體素(LH)、孕馬血清促性腺激素(PMSG)、促卵泡素(FSH)購自寧波三生藥業(yè)有限公司；氯前列烯醇(PG)購自上海計劃生育研究所；陰道栓(CIDR)購自新西蘭產(chǎn)EAZI-BREED-CIDR，20個/袋； Holding培養(yǎng)液為新西蘭生產(chǎn)，50 mL/袋；酒精、碘酒、新潔爾滅、抗生素、生理鹽水、青霉素、鏈霉素等為國產(chǎn)。

1.3供體羊超排處理方案

供體羊在發(fā)情周期內(nèi)任意一天陰道內(nèi)植入陰道栓(含0.3 g孕酮)，將其定為第0天，在第12天時按4 d 8針的方法連續(xù)肌肉注射促卵泡素(FSH)，按早晚劑量相等，每天劑量遞減的方法，平均每天遞減5 IU進行超排處理，并于第13天撤栓。撤栓24 h后每天3次用試情公羊試情。分別在撤栓后48 h和54 h進行腹腔內(nèi)窺鏡一次輸精。

1.4試驗分組

本試驗分不同輸精時間，即48 h和54 h對供體綿羊超排效果的影響進行比較試驗。此因素的試驗都是在其他因素基本一致的條件下進行。

1.5配種輸精方式

本實驗采用腹腔內(nèi)窺鏡方法進行輸精。人工采集種公羊精液，鏡檢，活力達0.6以上方可用于人工輸精。

1.6胚胎質(zhì)量鑒定

輸精后第5～6天手術(shù)法從子宮角沖胚，采集的胚胎用事先在培養(yǎng)箱預熱的平皿接收，寫好編號。在實體顯微鏡下分檢可用的胚胎放入在 35℃恒溫板上有胚胎保持液的平皿中，蓋好平皿蓋后待處理。根據(jù)胚胎的輪廓、細胞密度、分裂球的大小和數(shù)量、細胞的色澤等將胚胎分為 A、B、C 和 D 4個等級。其中 A、B、C 級胚胎可用于鮮胚的移植，但C級只能與A級或B級胚胎一起移植，D 級不可使用。

1.7受體處理與腹腔內(nèi)窺鏡法胚胎移植

使用CIDR+PMSG法，與供體羊同步埋植CIDR，在供體羊撤栓前半天撤除CIDR，注射280 IU PMSG，12 h 后每天3次用試情公羊試情，詳細記錄發(fā)情時間。采用腹部微創(chuàng)手術(shù)法處理受體羊，腹腔內(nèi)窺鏡觀察，單側(cè)卵巢1～3個黃體則移植1～2枚桑葚胚或囊胚。左右創(chuàng)口結(jié)晶磺胺處理后各縫1針后，注射黃體酮和抗生素。

1.8供受體羊術(shù)后處理

羊術(shù)后在單獨的圈內(nèi)觀察1～2 d，圈舍應勤加打掃，保持清潔干燥以防感染，如有異常應盡快進行治療處理，保證術(shù)后恢復良好。

1.9統(tǒng)計分析

使用SPSSv19.0對超排供體胚胎回收率、卵母細胞受精率、可用胚比率進行Z檢驗；平均可用胚胎數(shù)選擇單尾t檢驗方法，結(jié)果以平均值±標準誤表示。

2結(jié)果與分析

2.1撤栓后不同輸精時間對供體胚胎回收率的影響

將供體撤栓后48 h和54 h兩種不同的輸精時間對供體進行輸精后5～6 d的供體胚胎回收率進行統(tǒng)計分析(見表1)。結(jié)果顯示，撤栓后54 h進行輸精的供體胚胎回收率78.95%(330/418)極顯著高于撤栓后48 h輸精組供體胚胎回收率59.68%(262/439)(P<0.01)。

表1不同輸精時間對供體胚胎回收率的影響

輸精時間供體/只黃體總數(shù)/個沖胚總數(shù)/枚胚胎回收率/%撤栓后54h4841833078.95(330/418)A撤栓后48h5143926259.68(262/439)B

注：同列數(shù)據(jù)肩標不同大寫字母者表示差異極顯著(P<0.01)

2.2撤栓后不同輸精時間對供體胚胎受精率的影響

將供體撤栓后48 h和54 h兩種不同的輸精時間進行輸精后5～6 d的供體胚胎受精率進行統(tǒng)計分析(見表2)。結(jié)果顯示，撤栓后54 h進行輸精后供體回收卵子的受精率97.27%(321/330)極顯著高于撤栓后48 h輸精組供體受精率87.02%(228/262)(P<0.01)。

表2不同輸精時間對供體受精率的影響

輸精時間供體/只未受精卵/枚沖胚總數(shù)/枚受精率/%54h48933097.27(321/330)A48h513426287.02(228/262)B

注：同列數(shù)據(jù)肩標不同大寫字母者表示差異顯著(P<0.01)

2.3撤栓后不同輸精時間對供體平均可用胚數(shù)的影響

將供體撤栓后48 h和54 h兩種不同的輸精時間輸精后5～6 d的供體平均可用胚進行統(tǒng)計分析(見表3)。結(jié)果顯示，撤栓后54 h進行輸精后供體回收的平均可用胚數(shù)(6.30枚/只)顯著高于撤栓后48 h輸精組供體平均可用胚數(shù)(4.43枚/只)(P<0.05)。

表3不同輸精時間對供體平均可用胚數(shù)的影響

輸精時間供體/只沖胚總數(shù)/枚平均可用胚數(shù)/枚撤栓后54h483306.30±0.71a撤栓后48h512624.43±0.70b

注：同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)

2.4撤栓后不同輸精時間對供體可用胚率的影響

將供體撤栓后48 h和54 h兩種不同的輸精時間后5～6 d的供體可用胚率進行統(tǒng)計分析(見表4)。結(jié)果顯示，撤栓后54 h進行輸精供體回收的胚胎可用胚率89.70%(321/330)顯著高于撤栓后48 h輸精組供體胚胎可用胚率80.53%(211/262)(P<0.05)。

表4不同輸精時間對供體可用胚率的影響

輸精時間供體/只沖胚總數(shù)/枚可用胚/枚可用胚率/%54h4833029689.70(296/330)A48h5126221180.53(211/262)B

注：同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)

2.5撤栓后不同輸精時間對胚胎移植妊娠率的影響

將供體撤栓后48 h和54 h兩種不同的輸精時間進行供體輸精后5～6 d的供體可用胚進行移植的妊娠率進行統(tǒng)計分析(見表5)。結(jié)果顯示，撤栓后54 h進行輸精供體回收胚胎移植后的妊娠率70.44%(143/203)極顯著高于撤栓后48 h輸精組的胚胎移植妊娠率56.92%(111/195)(P<0.01)。

表5不同輸精時間對胚胎移植妊娠率的影響

輸精時間移植總數(shù)/只移植受體妊娠數(shù)/只移植妊娠率/%撤栓后54h20314370.44(143/203)A撤栓后48h19511156.92(111/195)B

注：同列數(shù)據(jù)肩標不同大寫字母者表示差異極顯著(P<0.01)

3討論

利用CIDR栓同期發(fā)情技術(shù)，使被處理的母羊發(fā)情同步化，集中輸精，集中產(chǎn)羔，便于集約化進行飼養(yǎng)管理[7]。Maxwell等[8]認為，陰道栓取出后48～60 h內(nèi)輸精較為合適，過早(24～36 h)和過遲(72～78 h)輸精的受精率均較低。本試驗對同期發(fā)情母羊采用撤栓后48 h和54 h進行子宮內(nèi)輸精的結(jié)果進行了統(tǒng)計比較，證實采用本試驗的同期發(fā)情方案、發(fā)情母羊在撤栓后54 h輸精時供體胚胎生產(chǎn)效率最高。

本試驗研究表明，54 h輸精胚胎回收率顯著高于48 h輸精組，主要是由于輸精時間較晚，排卵比較充分，因此避免了在輸精操作時牽引子宮角帶動輸卵管傘部移動而導致卵母細胞的丟失，使得收集到的卵母細胞較多，幾乎不存在卵母細胞丟失現(xiàn)象。這也是能夠得到更多的平均可用胚的主要原因。因而54 h后受精得到的胚胎回收率較高。

輸精時間晚，卵母細胞完全排出并充分成熟，縮短了精子在輸卵管中等待受精的時間，有利于精子活力的保持[9]。楊梅等[10～12]通過觀察山羊和綿羊超數(shù)排卵處理時間對卵母細胞成熟的影響研究發(fā)現(xiàn)，在撤栓后母羊發(fā)情時注射LH后的37～39 h卵母細胞成熟率較高，即卵母細胞在此時間段內(nèi)集中成熟。本實驗于撤栓后54 h輸精，與卵母細胞集中成熟的時間同步，48 h輸精效果差的原因可能是

卵母細胞尚未成熟完全，長時間的等待讓精子的受精能力急劇下降，最終導致受精結(jié)果不理想。即使能夠成功受精，也勢必會影響后續(xù)受精卵的分裂及發(fā)育，這樣的胚胎從供體子宮中回收后移植到受體子宮角內(nèi)，其適應性也遠比不上質(zhì)量好的胚胎，因此最后得到的受體妊娠率會比較高。總體來講，54 h輸精組卵母細胞回收率高，卵母細胞質(zhì)量好且成熟完全，致使輸精后得到的平均可用胚數(shù)、受精率和可用胚率顯著高于48 h組。

綜上所述，采用本試驗的同期發(fā)情方案，供體母羊在撤栓后54 h一次定時輸精較48 h輸精組供體胚胎生產(chǎn)效率高。

4參考文獻

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通訊作者：劉國世，男，教授，博士生導師。

作者簡介：艾合麥提·吐爾遜，男，高級畜牧師。

收稿日期：2016-01-04

中圖分類號：S826.3

文獻標識碼：A

文章編號：1005-2739(2016)02-0006-04