楊美英, 于　亭, 王春紅, 孫合美, 劉晶晶, 武志海

(1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 吉林 長春 130118； 2 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 吉林 長春 130118)

?

大豆卵磷脂和樂果有機(jī)磷降解菌的分離鑒定及酶活性比較

楊美英1?, 于亭1?, 王春紅1, 孫合美1, 劉晶晶1, 武志海2

(1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 吉林 長春 130118； 2 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 吉林 長春 130118)

摘要：【目的】明確2株有機(jī)磷降解菌Yj2和Yj3對(duì)大豆卵磷脂和樂果有機(jī)磷的降解特性及酶活性?！痉椒ā坷?6S rDNA鑒定從大豆土壤中分離得到的Yj2和Yj3菌株，在菌株最佳生長條件下，測定了不同磷源時(shí)菌體的酶活性并分級(jí)純化了有機(jī)磷降解酶?！窘Y(jié)果】 Yj2為醋酸鈣不動(dòng)桿菌Acinetobacter sp.，其最佳生長碳源為葡萄糖，氮源為硫酸銨，pH為8；Yj3為芽孢桿菌Bacillus sp.，其最佳生長碳源為葡萄糖，氮源為蛋白胨，pH為9。大豆卵磷脂為磷源時(shí)，Yj3的菌體生長情況稍優(yōu)于Yj2。樂果為磷源時(shí)，Yj2的菌體生長情況稍優(yōu)于Yj3；72 h內(nèi)Yj2酸性和堿性磷酸酶活性整體高于Yj3，而有機(jī)磷降解酶活性低于Yj3。硫酸銨沉淀法+陽離子交換層析分別從Yj2和Yj3菌體中成功分離純化了有機(jī)磷降解酶，SDS-PAGE結(jié)果顯示純化的蛋白均為單一條帶。Yj2硫酸銨沉淀法+陽離子交換層析的提純倍數(shù)是硫酸銨沉淀的7.77倍，硫酸銨沉淀為粗酶的1.35倍。Yj3硫酸銨沉淀法+陽離子交換層析的提純倍數(shù)是硫酸銨沉淀的5.07倍，硫酸銨沉淀為粗酶的1.53倍?！窘Y(jié)論】菌株Acinetobacter sp. Yj2和Bacillus sp. Yj3都具有降解大豆卵磷脂及樂果有機(jī)磷的特性，對(duì)有機(jī)磷降解起主要作用的是酸性磷酸酶、堿性磷酸酶及有機(jī)磷降解酶，它們在2株菌株對(duì)大豆卵磷脂和樂果降解過程中所起的作用有明顯差異?？蓮腨j2和Yj3菌體分離純化獲得提純倍數(shù)較高的有機(jī)磷降解酶蛋白。

關(guān)鍵詞：醋酸鈣不動(dòng)桿菌； 芽孢桿菌； 樂果； 大豆卵磷脂； 有機(jī)磷降解酶

在我國，耕地土壤的全磷含量一般為 2~11 mg·kg-1，土壤中有機(jī)磷一般占土壤全磷的30%~80%[1]。作物對(duì)磷肥的利用率也很低，當(dāng)季利用率一般只有5%~10%[2]。解磷菌能使土壤中難溶性或不溶性的磷轉(zhuǎn)化成易于被植物吸收利用的磷，從而提高土壤的供磷水平[3]。

根據(jù)其降解物質(zhì)的不同解磷菌又分為有機(jī)解磷菌和無機(jī)解磷菌，解磷菌種類繁多，解磷機(jī)制也不盡相同[4]。人們普遍認(rèn)為，解磷菌對(duì)有機(jī)磷的分解是通過分泌胞外酶實(shí)現(xiàn)的。在土壤缺磷的情況下，微生物會(huì)產(chǎn)生各種酶類，如植酸酶、核酸酶和磷酸酶等。這些酶可加速植酸、核酸、磷脂等含磷有機(jī)化合物的分解，促進(jìn)磷素釋放。較低的磷含量往往能促使植物根系和微生物分泌大量的磷酸酶，利于有機(jī)磷的分解。酸性磷酸酶是細(xì)菌和植物根系的產(chǎn)物，堿性磷酸酶僅由土壤中的細(xì)菌合成[5]，有機(jī)磷降解酶是一類水解酶，可水解有機(jī)磷酸三酯、有機(jī)磷硫酯和有機(jī)氟磷酸的各種磷酰鍵如P—O、P—S和P—F[6]。

目前有效的殺蟲劑多為有機(jī)磷化合物，這類化合物可以侵入生物的神經(jīng)系統(tǒng)而致其死亡[7]。樂果 (Dimethoate)是廣泛使用的有機(jī)磷農(nóng)藥之一，為中等毒性，在土壤中很容易沉降聚集，可通過食物鏈的富集作用轉(zhuǎn)移到人體,對(duì)人體產(chǎn)生危害[8]。本研究從大豆根際土壤中分離到的2株有機(jī)磷降解菌株Yj2和Yj3不僅能水解P—O鍵、降解大豆卵磷脂，同時(shí)可以降解二硫代磷酸脂樂果，進(jìn)一步就菌株對(duì)卵磷脂和樂果的降解能力及降解過程中磷酸酶活性與有機(jī)磷降解酶的特性進(jìn)行了研究。這對(duì)農(nóng)田磷素的循環(huán)利用以及適時(shí)降解剩余的有機(jī)磷農(nóng)藥，保護(hù)環(huán)境方面都有積極的意義，并可為有機(jī)磷解磷菌劑的開發(fā)與應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

2013年2月，利用對(duì)角線布點(diǎn)法，從吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆試驗(yàn)田(東經(jīng)125°19′、北緯43°43′)采集大豆根際土壤，4 ℃保存。

40%(w)樂果乳油(上海悅農(nóng)化工有限公司)；Sephadex G-25 Fine層析柱(GE Amersham Biosciences)；陽離子交換層析試劑SP Sepharose Fast Flow；層析系統(tǒng)AKTAprime plus(瑞典，型號(hào)11-0013-13)。

有機(jī)磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g·L-1，硫酸銨0.5 g·L-1，氯化鈉0.3 g·L-1，氯化鉀0.3 g·L-1，硫酸亞鐵0.03 g·L-1，硫酸錳0.03 g·L-1，碳酸鈣5 g·L-1，大豆卵磷脂0.2 g·L-1。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，NaCl 10 g·L-1。

1.2方法

1.2.1菌株的篩選及鑒定取1 g土壤樣品，加入100 mL滅菌的有機(jī)磷液體培養(yǎng)基，30 ℃、135 r·min-1搖床培養(yǎng)10 d后，取1 mL懸濁液逐級(jí)稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，分別取以上各濃度樣品100 μL涂布于以卵磷脂為有機(jī)磷源的固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24~48 h。選擇有較大溶磷圈的單菌落，反復(fù)純化4次，直至形成均一的菌落，將其轉(zhuǎn)至斜面培養(yǎng)至菌苔長出，置于4 ℃保存。

將純化后的有機(jī)磷解磷菌單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中，135 r·min-1、30 ℃恒溫培養(yǎng)過夜，12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，收集菌體。進(jìn)行細(xì)菌總DNA的提取，方法參照文獻(xiàn)[9]。以菌株總DNA為模板，利用細(xì)菌16s rDNA通用引物[10]進(jìn)行PCR，引物序列: R: 5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′，F(xiàn): 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′。反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，33個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，4 ℃保存。反應(yīng)體系：模板0.2 μL，上下游引物各0.2 μL，LATaqBuffer 2 μL，dNTPs (2.5 mmol·L-1)2 μL，eTaq聚合酶0.2 μL，無菌去離子水補(bǔ)至20 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳鑒定。同時(shí)將產(chǎn)物純化回收后，送上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。測序序列與GenBank進(jìn)行BLAST相似性比較，并利用Mega 5.10與相關(guān)菌株的16S rDNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

薛宇航：這篇作文寫完后，我自己讀了兩遍，感覺還不錯(cuò)，嚴(yán)老師也表揚(yáng)了我，說寫得不錯(cuò)。看過兩位“小編輯”的修改之后，我覺得他們改得真好，我的這篇作文，果然還有很大的提升空間?？磥恚院笪覍懲曜魑?，也要注意多修改了。

1.2.2菌株生長條件的優(yōu)化及菌體生長曲線的測定以有機(jī)磷培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，對(duì)不同碳源(葡萄糖、蔗糖、甘露糖)、氮源(蛋白胨，硝酸銨，硫酸銨)及pH(7、8、9)進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，挑取單菌落接種于5 mL LB培養(yǎng)基中，D600 nm=0.6時(shí)，種子液按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種于以大豆卵磷脂為有機(jī)磷源的培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)72 h，每隔6 h取樣，利用分光光度計(jì)測定D600 nm。采用Excel 2007進(jìn)行分析，進(jìn)而確定最佳的碳源、氮源及pH。

以優(yōu)化得到的最佳培養(yǎng)條件為基礎(chǔ)，分別以大豆卵磷脂、樂果為有機(jī)磷源的未接菌培養(yǎng)基為對(duì)照，另取150 μL 種子液分別接入150 mL有機(jī)磷培養(yǎng)基，30 ℃、150 r·min-1進(jìn)行培養(yǎng)，每12 h取1次樣，測定D600 nm。

1.2.3酶活性的測定酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性的測定參照伊鋆[11]的方法進(jìn)行，菌體培養(yǎng)同1.2.2，每隔12 h吸取1 mL發(fā)酵液，加入pH 6.5的MUB試劑，再加1 mL 0.025 mol·L-1對(duì)硝基苯磷酸二鈉溶液，震蕩10 s。37 ℃反應(yīng)1 h后，加入1 mL 0.5 mol·L-1氯化鈣溶液和4 mL 0.5 mol·L-1氫氧化鈉溶液，震蕩并過濾懸液，將濾液在420 nm處比色；堿性磷酸酶測定時(shí)所用MUB試劑pH為8.0，其他步驟同酸性磷酸酶測定方法。磷酸酶活性以每分鐘D420 nm增加0.001計(jì)為1個(gè)酶活力單位(U)。

有機(jī)磷降解酶活性的測定參照文獻(xiàn)[12]的方法。培養(yǎng)菌液，每隔12 h取菌液0.9 mL，8 000 r·min-1離心2 min，去上清，用0.9 mL pH 7.5的20 mmol·L-1的Tris-HCl懸浮為粗酶液。

取0.1 mL的0.05 mol·L-1樂果溶液、0.9 mL的粗酶液于比色管中，25 ℃條件下反應(yīng)45 min，加入1 mL 10%(φ)三氯乙酸終止反應(yīng)，再加入1 mL 10%(w)碳酸鈉溶液顯色，測定D405 mm。以D405 mm增加0.001計(jì)為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.4有機(jī)磷降解酶的純化將D600 nm=0.6 的Yj2種子液以體積分?jǐn)?shù)為1‰的量接入1 L 以卵磷脂為磷源的有機(jī)磷培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r·min-1，培養(yǎng)48 h后4 ℃、4 000 r·min-1離心30 min收集菌體。每克菌以15 mL 20 mmol·L-1的Tris-HCl(pH 7.5)緩沖液懸浮，每毫升溶液加入1 mg溶菌酶充分?jǐn)嚢韬? ℃靜置30 min，冰浴超生波破碎(1 400 W、工作5 s、間歇9 s、50次循環(huán))。4 ℃下10 000 r·min-1離心20 min。取上清按硫酸銨質(zhì)量濃度為100、200、400和650 g·L-1進(jìn)行逐步沉淀。沉淀用40 mL的Tris-HCl(20 mmol·L-1pH 7.5)緩沖液懸起后，進(jìn)行Sephadex G-25 Fine層析柱脫鹽，取流川液再進(jìn)行陽離子交換層析，分別以含有0.1、0.2和0.5 mol·L-1NaCl的Tris-HCl(20 mmol·L-1，pH 7.5)進(jìn)行階段洗脫；利用層析系統(tǒng)檢測流出組分。取流川液及出峰時(shí)的流出液體進(jìn)行有機(jī)磷降解酶活力測定，酶活力測定方法同1.2.3。SDS-PAGE檢測分離結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1有機(jī)磷解磷菌的分離與鑒定

以大豆卵磷脂和樂果為磷源，檢測和鑒定從吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆試驗(yàn)田土壤中分離的2株具有明顯解磷效果的菌株，菌株分別命名為Yj2和Yj3。2株菌在以大豆卵磷脂(圖1A、1D)和樂果(圖1B、1E)為有機(jī)磷源的固體培養(yǎng)基中生長時(shí)，均有明顯透明圈產(chǎn)生。100倍油鏡觀察Yj2(圖1C)和Yj3(圖1F)發(fā)現(xiàn)，2株菌均為桿狀。

A、B分別為以大豆卵磷脂和樂果為磷源時(shí)Yj2的溶磷效果；C:Yj2的菌株形態(tài)(100×油鏡)；D、E分別為以大豆卵磷脂和樂果為磷源時(shí)Yj3的溶磷效果；F:Yj3的菌株形態(tài)(100×油鏡)。

圖1Yj2和Yj3溶磷效果和菌株形態(tài)

Fig.1Effects on phosphorus-solubilizing and morphology of strains Yj2 and Yj3

將測序序列利用Genbank DNA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST相似性比較。結(jié)果表明菌株Yj2 16S rDNA基因序列與Acinetobactergenomosp. 13(FJ694759.1)相似性較高，相似性為99%，因此Yj2被鑒定為醋酸鈣不動(dòng)桿菌Acinetobactersp.；菌株Yj3 16S rDNA基因序列與Bacillussp. B2101(JX266369.1)有較高的相似性，相似性為99%，因此Yj3被鑒定為芽孢桿菌Bacillussp.。

M: DL 2000 Marker,1、3為Yj2，2、4為Yj3；A：PCR產(chǎn)物，B：酶切結(jié)果。

圖2Yj2和Yj3 16S rDNA基因的克隆及重組質(zhì)粒的酶切結(jié)果

Fig.2Amplification of 16S rDNA gene and restriction enzyme digestion of recombinant plasmids of Yj2 and Yj3

利用Mega 5.10構(gòu)建Yj2和Yj3基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖3A可知，與Yj2相似性較高的11個(gè)菌株的16S rDNA序列在系統(tǒng)發(fā)育樹中主要分為2個(gè)大的分支。其中，Yj2屬于第1個(gè)分支。由圖3B可知，與Yj3同源性較高的11株菌的16S rDNA序列在系統(tǒng)發(fā)育樹中沒有形成明顯的獨(dú)立分支。

2.2Yj2和Yj3生長條件的優(yōu)化及2種磷源條件下生長曲線的測定

對(duì)Yj2和Yj3菌株生長條件中碳源、氮源、pH進(jìn)行優(yōu)化。Yj2的最佳碳源為葡萄糖，氮源為硫酸銨，pH為 8。Yj3的最佳碳源為葡萄糖，氮源為蛋白胨，pH 為9。

以大豆卵磷脂為磷源時(shí)，Yj2和Yj3的生長曲線見圖4A，Yj2和Yj3菌體生長曲線均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。Yj2在36 h菌體生長最旺盛，之后呈現(xiàn)下降趨勢。Yj3在48 h菌體生長最旺盛，D600 nm為0.516，之后呈下降趨勢。以樂果為磷源時(shí)，Yj2和Yj3的生長曲線見圖4B，Yj2和Yj3菌體生長曲線均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。Yj2在60 h菌體生長量達(dá)到最大，D600nm為0.579，之后呈下降趨勢。Yj3在48h菌體生長量達(dá)最大，之后呈現(xiàn)下降趨勢。72 h內(nèi)Yj2的菌體生長情況稍優(yōu)于Yj3。

圖3　Yj2 和Yj3 基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4　以大豆卵磷脂和樂果為磷源時(shí)Yj2和Yj3的生長曲線

2.3有機(jī)磷降解菌解磷過程中的酶活性分析

以樂果為磷源測定Yj2和Yj3酸性磷酸酶、堿性磷酸酶與有機(jī)磷降解酶的酶活性。Yj2和Yj3的酸性磷酸酶活性均呈先增長后下降的趨勢(圖5A)，且分別在60 和48 h出現(xiàn)峰值，酶活性分別為566和483 U。而且，72 h時(shí)Yj2酸性磷酸酶活性高于Yj3。

Yj2和Yj3的堿性磷酸酶活性也呈先增長后下降的趨勢(圖5B)，峰值出現(xiàn)的時(shí)間分別與酸性磷酸酶相同，酶活性分別為178和275 U。在72 h內(nèi)，酸性磷酸酶活性和堿性磷酸酶活性交替增加，但最大值時(shí)的酸性磷酸酶活性要高于堿性磷酸酶活性。

Yj2和Yj3的有機(jī)磷降解酶活性亦呈先增長后下降的趨勢(圖5C)，Yj2峰值出現(xiàn)的時(shí)間與酸性磷酸酶相同，Yj3則在36 h出現(xiàn)峰值，最大酶活性分別為232和408 U。且72h內(nèi)Yj2有機(jī)磷降解酶活性總是低于Yj3。

圖5　樂果為磷源時(shí)Yj2和Yj3的酸性磷酸酶活性、堿性磷酸酶活性和有機(jī)磷降解酶活性測定

Fig.5The enzyme activity of acid phosphatase, alkaline phosphatase and organophosphorus degradation of Yj2 and Yj3 using dimethoate as phosphorus source

2.4有機(jī)磷降解酶的分級(jí)純化及酶活性測定

為了進(jìn)一步明確Yj2和Yj3菌株中有機(jī)磷降解酶的特性，收集以樂果為磷源、生長60 h 的Yj2所有菌體和48 h的Yj3所有菌體，超聲波破碎后，進(jìn)行硫酸銨沉淀以及硫酸銨沉淀+陽離子交換層析分離純化，并對(duì)有機(jī)磷降解酶活性進(jìn)行測定。結(jié)果表明，兩者均在65%(w)硫酸銨沉淀中測得有機(jī)磷降解酶的活性，過G-25脫鹽柱后，在陽離子交換層析過程中，兩者在0.2 mol·L-1氯化鈉洗脫液中酶活性均較強(qiáng)。以SDS-PAGE檢測蛋白結(jié)果顯示Yj2(圖6A)和Yj3(圖6B)純化的蛋白均為單一條帶。

M為蛋白Marker，1為流川液，2~4分別表示0.1、0.2、0.5 mol·L-1 NaCl;A:Yj2,B:Yj3。

對(duì)分級(jí)純化的酶液進(jìn)行酶活力測定，結(jié)果見表1。Yj2粗酶、硫酸銨沉淀以及硫酸銨沉淀+陽離子交換洗脫液有機(jī)磷降解酶的比活力分別為57.41、77.25和600.00。提純后的酶活性均有所提高，硫酸銨沉淀+陽離子交換層析酶提純是硫酸銨沉淀的7.77倍，硫酸銨沉淀為粗酶的1.35倍。Yj3粗酶、硫酸銨沉淀以及硫酸銨沉淀+陽離子交換洗脫液有機(jī)磷降解酶的比活力分別為60.17、92.05和466.48。提純后的酶活力分別都提高了一定的倍數(shù)，硫酸銨沉淀+陽離子交換層析酶提純是硫酸銨沉淀的5.07倍，硫酸銨沉淀為粗酶的1.53倍。

表1有機(jī)磷降解酶分級(jí)純化的酶活力分析

Tab.1Classification and purification of organophosphate degradation enzyme activity analysis

解磷菌樣品處理1)酶活力/Um(蛋白)/mg比活力Yj2Ⅰ279.004.8657.41Ⅱ197.002.5577.25Ⅲ150.000.25600.00Yj3Ⅰ215.423.5860.17Ⅱ150.041.6392.05Ⅲ97.960.21466.48

1)Ⅰ：粗酶；Ⅱ：硫酸銨沉淀；Ⅲ：硫酸銨沉淀+陽離子交換層析。

3討論與結(jié)論

長期施用在田間的磷肥、農(nóng)藥以及植物根際殘留的有機(jī)磷化合物都是植物不能吸收利用的難溶無效態(tài)磷，不但造成了土壤中磷素的積累，也對(duì)環(huán)境造成了極大的污染。解磷微生物可以有效地分解土壤中的無效態(tài)磷，釋放植物可以吸收利用的磷素[13]，從而提高土壤供磷水平。段雪梅等[14]從太湖有機(jī)聚集體上分離純化出1株瓊氏不動(dòng)桿菌Acinetobacterjuniipjj-1，發(fā)現(xiàn)其對(duì)有機(jī)磷具有降解作用。同時(shí)有研究表明，假單胞菌屬Pseudomonassp. LPx[15]、 節(jié)桿菌屬Arthrobactersp. L3[16]、伯克霍爾德氏菌屬Burkholderiasp. CP7[17]、甲基桿菌屬M(fèi)ethylobacteriumsp.MAP-2[18]和寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonassp.PF32[19]等菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥樂果、毒死蜱、甲胺磷和甲基對(duì)硫磷也有較好的降解作用。

本研究從大豆根際土壤中分離得到2株對(duì)卵磷脂和樂果均有較好降解能力的菌株，鑒定并分別命名為醋酸鈣不動(dòng)桿菌AcinetobacterYj2和芽孢桿菌BacillusYj3。對(duì)Yj2和Yj3的生長條件優(yōu)化結(jié)果表明，2株菌株最佳碳源均為葡萄糖。這與趙小蓉等[20]研究發(fā)現(xiàn)節(jié)桿菌1TCRi7只有在葡萄糖為碳源時(shí)才具有溶磷能力的試驗(yàn)結(jié)果一致。陳燕飛等[21]研究表明大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌Staphyloccocusaureus的最佳生長pH為7，而Yj2和Yj3的最佳生長pH分別為8和9。目前，關(guān)于酸性磷酸酶與堿性磷酸酶特性的研究已有較多報(bào)道[22-23]。丁洪等[23]的試驗(yàn)中，大豆植株的酸性磷酸酶活性最高為85.19 U。閆建國等[24]發(fā)現(xiàn)，在久效磷的作用下，降解菌的堿性磷酸酶活性最高為350 U。本試驗(yàn)對(duì)樂果為磷源時(shí)Yj2和Yj3的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性測定結(jié)果表明，0~72 h內(nèi)，Yj2的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性均在60 h時(shí)出現(xiàn)最大值，分別為566 和178 U。Yj3的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性均在48 h時(shí)出現(xiàn)最大值，分別為483 和275 U。

由于部分有機(jī)磷降解酶可以降解有機(jī)磷農(nóng)藥，又稱為有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶。Munnecke[25]發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶的降解效果遠(yuǎn)勝于微生物本身，特別是對(duì)低濃度農(nóng)藥的降解效果更好。因此，有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶對(duì)農(nóng)藥的降解已被公認(rèn)為是消除農(nóng)藥殘留的最有潛力的新方法[26]。本試驗(yàn)對(duì)樂果為磷源時(shí)Yj2和Yj3的有機(jī)磷降解酶利用硫酸銨沉淀法和硫酸銨沉淀+陽離子交換層析法進(jìn)行純化及酶活性測定，結(jié)果表明，72 h內(nèi)Yj2和Yj3有機(jī)磷降解酶分別在60 和36 h出現(xiàn)最大值，分別為232 和408 U。Yj2經(jīng)硫酸銨沉淀和硫酸銨沉淀+陽離子交換層析提純后的酶活力分別為粗酶活力的1.35和7.77倍；Yj3提純后的酶活力分別為粗酶活力的1.53和5.07倍。純化出的能夠降解樂果的有機(jī)磷降解酶均與陽離子交換柱結(jié)合，帶正電荷，這與劉玉煥等[27]從曲霉菌中分離純化出有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶性質(zhì)相同。

本試驗(yàn)從大豆根際土壤中篩選并純化得到了2株具有穩(wěn)定降解有機(jī)磷化合物的菌株，Yj2為醋酸鈣不動(dòng)桿菌Acinetobactersp.、Yj3為芽孢桿菌Bacillussp.，2株菌既能降解大豆卵磷脂，又能降解有機(jī)磷農(nóng)藥樂果。Yj2的最佳培養(yǎng)條件為葡萄糖、硫酸銨和pH 8。Yj3的最佳培養(yǎng)條件為葡萄糖、蛋白胨和pH 9。以大豆卵磷脂為有機(jī)磷源時(shí)Yj3的菌體生長情況稍優(yōu)于Yj2，以樂果為有機(jī)磷源時(shí)Yj2的菌體生長情況稍優(yōu)于Y3。Yj2酸性和堿性磷酸酶活性整體高于Yj3，有機(jī)磷降解酶的活性低于Yj3。通過硫酸銨沉淀法和硫酸銨沉淀+陽離子交換層析法，分別從Yj2和Yj3菌體中純化獲得了有機(jī)磷降解酶。

參考文獻(xiàn)：

[1]WANG Y, YE X S, DING G D, et al. Overexpression ofphyAandappAgenes improves soil organic phosphorus utilisation and seed phytase activity inBrassicanapus[J]. Plos one, 2013, 8(4):1- 9.

[2]杜育梅, 劉國道. 植物利用磷素的有效性研究進(jìn)展[J].華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 1(2)：41-47.

[3]SHARMA S B, SAYYED R Z, TRIVEDI M H, et al. Phosphate solubilizing microbes: Sustainable approach for managing phosphorus deficiency in agricultural soils[J/OL]. Springer Plus, 2013, 2:587-601. http://www.springerplus.com/content/2/1/587.

[4]YI Y M, HUANG W Y, GE Y. Exopolysaccharide: A novel important factor in the microbial dissolution of tricalcium phosphorus[J]. World J Microbiol Biotech, 2008, 24(7): 1059-1065.

[5]劉淵,李喜煥,孫星,等.磷脅迫下大豆酸性磷酸酶活性變化及磷效率基因型差異分析[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2012,13(4):521-528.

[6]問縣芳, 袁永澤, 習(xí)海玲, 等. 一種新型有機(jī)磷降解酶的二異丙基氟磷酸酯水解特性研究[J]. 華中師范大學(xué)學(xué)報(bào), 2013,47(1):53-56.

[7]SALMAN A, FARD A T, NASIR A, et al. Comparative analysis of organophosphate degrading enzymes from diverse species[J]. Bioinformation, 2010, 5(2):67.

[8]黃雅,李政一,趙博生.有機(jī)磷農(nóng)藥樂果降解的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].環(huán)境科學(xué)與管理, 2009,43(4):20-24.

[9]薩姆克魯斯 J 拉塞爾.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].3版.北京：科學(xué)出版社, 2002：8.

[10]BAKERMANS C, MADSEN E. Diversity of 16S rDNA and naphthalene dioxygenase genes from coal-tar-waste-contaminated aquifer waters[J]. Microb Ecol, 2002,44(2):95-106.

[11]伊鋆. 高效解磷細(xì)菌的篩選及解磷機(jī)理的研究[D].大連：大連理工大學(xué), 2011:30

[12]金彬明,劉佳明.海洋微生物有機(jī)磷降解酶的純化與性質(zhì)研究[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志, 2007,19(1):37-39.

[13]伍寧豐, 梁果義,鄧敏捷,等.有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶及其基因工程研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2003(5):9-12.

[14]段雪梅,馮勝,王小冬,等.一株分離自太湖有機(jī)聚集體上的有機(jī)磷降解細(xì)菌的鑒定及其降解特性研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2008,27(2):741-747.

[15]肖佳沐,袁海平,樓紫陽,等.一株樂果降解菌的篩選、鑒定及其降解特性研究[J].環(huán)境污染與防治, 2010, 32(12):67-71.

[16]BHADBHADE B J, SARNAIK S S, KANEKAR P P. Biomineralization of an organophosphorus pesticide,monocrotophos, by soil bacteria[J]. J Appl Microbiol, 2002,93(2)：224-234.

[17]史延華. CP1 菌株的分離、篩選及其對(duì)毒死蜱的降解[J].微生物學(xué)通報(bào), 2011,38(9):1331-1338.

[18]王莉.Hyphomicrobiumsp.MAP-1菌株修復(fù)甲胺磷乙酰甲胺磷和水胺硫磷污染土壤的實(shí)驗(yàn)研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2013,32(1):81-87.

[19]許育新,馮昭中,陸鵬,等.甲基對(duì)硫磷降解菌PF32的分離鑒定及其降解特性研究[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào), 2009,11(3):329-334.

[20]趙小蓉,林啟美,李保國.C、N 源及 C/N 比對(duì)微生物溶磷的影響[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào), 2002, 8(2): 197-204.

[21]陳燕飛.pH 對(duì)微生物的影響[J].太原師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2009, 8(3): 121-124.

[22]鐘傳青,黃為一.不同種類解磷微生物的溶磷效果及其磷酸酶活性的變化[J].土壤學(xué)報(bào), 2005,42(2):286-293.

[23]丁洪，李生秀，郭慶元,等.酸性磷酸酶活性與大豆耐低磷能力的相關(guān)研究[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào), 1997,3(2):123-128.

[24]閆建國,汝少國,王蔚.久效磷對(duì)黃鱔乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶和磷酸酶活性的影響[J].安全與環(huán)境學(xué)報(bào),2006,6(3):61-63.

[25]MUNNECKE D M. Enzymatic detoxification of waste organophosphorus pesticides[J].J Agric Food Chem, 1980, 28(1): 105-111.

[26]伍寧豐,鄧敏捷,史秀云,等.一種新的有機(jī)磷降解酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].科學(xué)通報(bào)， 2003， 48(23): 2446-2450.

[27]劉玉煥,鐘英長. 華麗曲霉Z58有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶的純化和性質(zhì)[J].微生物學(xué)報(bào), 2000,40(4):430-434.

【責(zé)任編輯霍歡】

Isolation and identification of bacteria degrading soy lecithin and dimethoate and comparision of enzyme activities

YANG Meiying1?, YU Ting1?, WANG Chunhong1, SUN Hemei1, LIU Jingjing1, WU Zhihai2

(1 Collge of Life Science， Jilin Agricultural University， Jilin 130118， China；2 Faculty of Agronomy， Jilin Agricultural University， Jilin 130118， China)

Abstract：【Objective】 In order to clarify degradation characteristics and enzyme activities of two organic phosphorus degrading bacteria in soy lecithin and dimethoate.【Method】Bacterium strains Yj2 and Yj3 were isolated from soy soil and identified by 16S rDNA identification method. The growth conditions of Yj2 and Yj3 were optimized by orthogonal test. The enzyme activities from two strains were determined under different phosphorus sources, and organophosphate degrading enzymes were classified and purified.【Result】Yj2 was identified as Acinetobacter sp., and Yj3 was identified as Bacillus sp.. The result of growth condition optimization showed that the best carbon and nitrogen source and pH values for strain Yj2 and Yj3 were glucose, ammonium sulfate, pH 8 and glucose, peptone, pH 9, respectively. The growth of Yj3 was slightly better than that of Yj2 when the phosphorus source was soy lecithin. However, the growth trend was the opposite with dimethoate as the phosphorus source. Within 72 h of dimethoate being the phosphorus source, acid phosphatase activity and alkaline phosphatase activity of Yj2 were generally higher than that of Yj3, but organophosphate degradation enzyme activiy of Yj2 was lower than those of Yj3. The organophosphorus degradation enzymes were isolated and purified respectively from strains Yj2 and Yj3 by ammonium sulfate precipitation followed with cation exchange chromatography. SDS-PAGE results showed that the purified proteins were both a single band. The purification ratio of ammonium sulfate precipitation followed with cation exchange was 7.77 times higher than that of the ammonium sulphate precipitation for Yj2, and the latter was 1.35 times higher than crude enzyme for Yj2. The corresponding purification ratios for Yj3 were 5.07 and 1.53 times respectively.【Conclusion】 Acinetobacter sp. Yj2 and Bacillus sp. Yj3 both can degrade soy lecithin and dimethoate. The activities of acid phosphatase, alkaline phosphatase and organophosphate degradation enzymes, which play the main roles on degrading organic phosphate, have obvious differences between two strains in soy lecithin and dimethoate degrading process. The organophosphate degradation enzymes with relatively high purity can be isolated and purified from YJ2 and Yj3, respectively.

Key words：Acinetobacter calcoaceticus; Bacillus; dimethoate; soy lecithin; organophosphate degrading enzyme

中圖分類號(hào)：S154.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001- 411X(2016)02- 0065- 08

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31201687)

作者簡介：楊美英(1974—)女，副教授，博士，E-mail: jlaumeiying@163.com；于亭(1989—)，女，碩士，E-mail: m18643173059@163.com；?對(duì)本文貢獻(xiàn)相同

收稿日期：2015- 06- 16優(yōu)先出版時(shí)間：2016- 01- 18

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20160118.1651.016.html

楊美英, 于亭, 王春紅，等.大豆卵磷脂和樂果有機(jī)磷降解菌的分離鑒定及酶活性比較[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,37(2):65- 72.